微⽣物学检查⽅法验证与评价要求
审评三部霍秀敏宁黎丽成海平魏农农
摘要：本⽂系统阐述了微⽣物限度和⽆菌检查法验证的内容和技术评价要求，⽬的是规范微⽣物限度和⽆菌检查⽅法验证⼯作，供注册申请⼈在进⾏微⽣物限度和⽆菌检查研究时参考，微⽣物限度和⽆菌检查的评价要求，可⽤于具体的审评⼯作。
关键词：微⽣物学检查；⽅法验证；评价要求。
⼀、概述
本⽂中的微⽣物学检查⽅法包括微⽣物限度检查法和⽆菌检查法。微⽣物限度检查法系检查⾮规定灭菌制剂及其原料药、辅料受微⽣物污染程度的⽅法；包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。⽆菌检查法系⽤于检查药典要求的⽆菌药品、原料药、辅料等是否⽆菌的⽅法；若检查结果符合规定，表明在该检验条件下未发现微⽣物污染。 中国药典2000年版及以前的版本虽然收载了微⽣物限度检查法和⽆菌检查法，但在如何保证检验⽅法的
科学性及检验结果的准确性⽅⾯存在⼀些问题，与国外药典的相关要求⽐较有⼀定差距，关键是未明确对检验⽅法进⾏必要的⽅法学验证。以前品种的申报资料中⼀般仅提供微⽣物限度检查或⽆菌检查的检查结果，⽆⽅法学验证内容。但从保证药品安全性的实际出发，不同品种需要选择建⽴各⾃适当的检查⽅法，即使是仿制药，由于不同⽣产企业采⽤的⼯艺、辅料等的不同，其产品可能表现出不同的抑菌特性，进⾏微⽣物限度检查或⽆菌检查时，具体的检查⽅法也不能简单地照搬，需要通过试验验证核实已有的试验⽅法和检测系统是否适⽤，因此，也需要进⾏必要的⽅法验证。 中国药典2005年版对微⽣物限度检查法和⽆菌检查法进⾏了修订完善，明确规定进⾏药品微⽣物限度检查或⽆菌检查时应进⾏⽅法验证，⽬的是确认试验中应选择药典收载的何种供试液制备⽅法、何种测定⽅法，以及验证确定的检测系统是否适⽤于该药品的检验。如果供试品有抑菌性，影响测定结果，则应采⽤适当的⽅法消除供试液的抑菌活性后再进⾏检查。也就是说，只有通过⽅法验证，才能确定针对具体品种的具体的检验⽅法，保证采⽤的⽅法的科学性和检验结果的准确性。
⼆、⽅法验证的思路
⾸先了解供试品是否有抑菌性、抑何种菌，再考虑选择适当的⽅法消除或降低供试品的抑菌性，然后⽤试验验证所采⽤的⽅法已经消除了抑菌性（能使⼈⼯加⼊的各种试验菌⽣长良好），特别是能满⾜对产品最敏感菌的⽣长；最后将所作的试验记录在案，形成确认该供试品在该检验量及该检验条件下，已充分消除抑菌性，能确保试验结果准确可靠的验证报告。
微⽣物限度和⽆菌检查⽅法验证试验可概括描述为：在采⽤的检验⽅法和过程中，通过分别加⼊规定量的代表性微⽣物，以验证供试品是否在规定的检验量、在所采⽤的检验条件下⽆抑菌性，或已充分消除了抑菌性（供试品本⾝的以及操作系统中可能对微⽣物⽣长有影响的各种因素），并且所⽤⽅法对微⽣物⽣长⽆不良影响，从⽽确认检验⽅法的有效性，保证检验结果的准确可靠。整个试验过程中的每⼀个环节均应有合理的证明，保证其对结果的判断没有影响。
三、⽅法验证的重点
1、验证制成适宜供试液的前处理⽅法，证明⽅法对微⽣物⽣长、检出⽆影响。
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2、验证样品有⽆抑菌性、抑什么菌？最敏感的菌是那⼀个？其结果将直接影响后续检验⽅法的选择和操作步骤的进⾏，同时是最终所选检验⽅法和操作步骤合理性的证明。
3、验证消除样品抑菌性的⽅法，证明⽅法的有效性及⽅法对污染菌⽣长⽆影响；如何选择合理、适宜、简单有效的消除抑菌性的⽅法是当前验证⼯作的关键。
四、⽅法验证的步骤与内容
1、制备验证试验⽤菌液
按药典⽆菌检查法中培养基灵敏度检查项中试验⽤菌液的制备⽅法将规定需⽤的试验菌分别制成每毫升中含10～100个菌（CFU）的供试菌液。
2、样品的前处理⽅法
样品的前处理⽅法是验证试验的⼀部分，需证明所⽤的处理⽅法对各试验菌的⽣长⽆影响。
根据供试品的性状，选⽤以下适宜的⽅法，或⼏种⽅法联合使⽤：
溶解：验证所⽤溶液、助溶剂和⽔浴助溶温度对微⽣物的⽣长⽆影响。
乳化：验证所⽤乳化剂和⽔浴助溶温度的有效性、使⽤量及对微⽣物的⽣长⽆影响。
破乳：验证所⽤破乳剂的有效性、使⽤量及对微⽣物的⽣长⽆影响。
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萃取：验证有机相选择的合理性、有效性及对微⽣物的⽣长⽆影响。
稀释：验证降低供试品相对抑菌浓度的有效稀释倍数。
离⼼：验证所⽤转速、时间和微⽣物的分布情况。
应说明采取某种前处理⽅法的原因，如样品不需要特别的前处理就能制成均匀的供试液，这⼀步可以省掉，直接进⼊确定样品有⽆抑菌性的步骤。
3、确定供试品是否有抑菌性、抑什么菌？
通过⽂献资料或申报资料中的药效学资料，了解其对不同细菌的MIC，参考已经验证过
铑粉的品种、抗菌药物可根据抗菌谱确定敏感菌、中成药抗菌谱不清楚，⾄少需选择⼀株细菌和⼀株真菌来试验。也可以直接通过验证试验确定抑菌性。
试验确定抑菌性的⽅法：在规定量的供试液中加⼊试验⽤微⽣物10～100个，如微⽣物⽣长良好，说明供试品对该种微⽣物⽆抑菌活性。如已⽤药典规定的各试验菌进⾏了试验，结果均能⽣长良好，说明供试品⽆抑菌性，可⽤常规⽅法检验。如加⼊的微⽣物不⽣长或⽣长缓慢，说明供试品有抑菌性；如加⼊的微⽣物中有某⼀种菌最不能⽣长或⽣长最缓慢，这⼀种菌就是该样品的敏感菌。
4、选择适当的⽅法消除或有效降低供试品的抑菌性
根据供试品的特性选择药典规定的消除其抑菌性的⽅法（⼀种或⼏种⽅法联合），或根据药物的化学特性，寻出其他合理、有效的⽅法，特别是有效的中和剂；并通过模拟试验（验证试验）对消除或降低抑菌性的效果进⾏检验。
⽆菌检查可采⽤：①薄膜过滤法；②中和法（⽬前药典仅收载β-内酰胺酶处理法）。
①薄膜过滤法适⽤于液体供试品和可溶于⽔的固体供试品（只要许可，应⾸先采⽤）。验证的重点是确定滤膜的适⽤性、确定冲洗的⽅法和冲洗液的⽤量。注塑机联网
②中和法适⽤于能充分被其灭活抑菌活性的样品（如β-内酰胺酶灭活β-内酰胺类、对氨基苯甲酸灭活磺胺类）。验证的重点是确定中和剂有效、证明对污染微⽣物的⽣长⽆毒性，以及加⼊的⽅法和加⼊量。
检验供试品是否已消除或降低抑菌性的验证试验：每种试验菌为⼀组，每组两管，其中⼀管为供试品加试验菌管，另⼀管为试验菌对照管。
结果判断：如平⾏3次独⽴试验，各管微⽣物均⽣长良好，说明供试品已消除了抑菌活性；可以进⾏该品的⽆菌检查。如有供试品管的微⽣物⽣长微弱、缓慢或不⽣长，说明供试品仍有抑菌性；应考虑进⼀步增加冲洗量或中和剂的⽤量，以消除抑菌性，并重新进⾏验证，直⾄验证证明已充分消除或有效降低供试品的抑菌性为⽌。
取暖袋微⽣物限度检查可采⽤：①培养基稀释法；②离⼼沉淀法；③薄膜过滤法；④中和法。
①培养基稀释法：取规定量的供试品/供试液加⾄较⼤量的培养基中，使单位体积内的供试品浓度降低
⾄不显抑菌作⽤。该⽅法适⽤于不能采⽤薄膜过滤法且抑菌活性较弱的样品。验证的重点是确定培养基量增加⾄多少才能使供试品/供试液不显抑菌活性。
②离⼼沉淀法：利⽤沉降系数差异分离去掉药渣、含抑菌活性的部分，留下含微⽣物的部分。该⽅法适⽤于不能采⽤薄膜过滤等⽅法的样品。验证的重点是确定能将药渣、抑菌部分分离掉⽽留下微⽣物的有效的离⼼率。
③薄膜过滤法：同⽆菌检查法，常可与离⼼沉淀法联合使⽤。
④中和法：同⽆菌检查法。
实践证明⼏种⽅法联合使⽤效果更好。薄膜过滤法和中和法是最有效的消除抑菌性的⽅法。但是应对样品采取某种消除抑菌性的⽅法的原因进⾏说明。
由于微⽣物限度检查由菌数计数和控制菌检查两部分组成，所以，在检验是否已消除或有效降低抑菌性的试验中也应分别进⾏验证。
微⽣物限度检查中的菌数计数属定量试验。验证试验是通过对加⼊的各种规定微⽣物的回收率试验进⾏。验证中可以仅选⽤已确定的敏感菌，这样可减少⼯作量，因为，能满⾜敏感菌⽣长的条件必然能满⾜其他菌的⽣长。也可以完全按照药典规定，逐⼀进⾏每种试验菌的验证：对每种试验菌均建⽴（
1）试验组（供试液加菌液组）?菌数计数测得CFU1；（2）菌液组?菌数计数测得CFU2；（3）供试液本⾝对照组?菌数计数测得CFU3；（4）稀释剂对照组?菌数计数测得CFU4。验证试验和对验证结果的判断：应符合CFU4÷CFU2≥70%、（CFU 1－CFU3）÷CFU2 ≥70%。如两个回收率均≥70%，则说明所⽤⽅法已消除
了供试品的抑菌性；可以按该⽅法进⾏该品种的菌数计数检查。如回收率⼩于70%，则说明供试品仍有抑菌性，应进⼀步考虑采取适宜的措施以消除其抑菌性，并重新进⾏验证，直⾄验证的回收率均≥70%，证明已充分消除或有效降低供试品的抑菌性为⽌。
微⽣物限度检查中的控制菌检查属定性试验。验证试验应同时设置：（1）⽬标菌阳性对照管；（2）供试品＋⽬标菌管；（3）阴性对照管；（4）⾮⽬标菌对照管。验证试验和对验证结果的判断：（1）⽬标菌阳性对照管菌必须⽣长良好；（2）供试品＋⽬标菌管⽣长良好；（3）阴性对照管必须⽆菌⽣长；（4）阴性菌对照必须⽆菌⽣长。上述试验成⽴，则说明所⽤⽅法已消除或充分减低了供试品的抑菌性；可以按该⽅法进⾏该品种的控制菌检查。如出现（2）供试品＋⽬标菌管⽣长缓慢、或不⽣长，则说明供试品仍有抑菌性，应进⼀步考虑采取适宜的措施以消除其抑菌性，并进⾏重新验证，直⾄验证结果中（2）供试品＋⽬标菌管与（1）⽬标菌阳性对照管相同，证明已充分消除或有效降低供试品的抑菌性为⽌。如出现（3）阴性对照管有菌⽣长；（4）阴性菌对照管有菌⽣长；则说明试验不成⽴，所⽤⽅法不专属，应寻原因并重新进⾏验证试验。
五、⽅法验证中应注意的问题与评价要求
1、验证试验的完整性
验证试验的完整性与⽅法的科学性密切相关，验证⼯作不完整，就不能全⾯体现供试品和试验过程对微⽣物的影响情况，则很可能影响或⼲扰对最终试验结果的判断。故应按照中
国药典2005年版的要求进⾏⽅法验证。特别是对某些具有抑菌性的供试品，需采取适当的⽅法消除或有效降低供试品的抑菌性。在对供试品进⾏特殊处理时，既要考察供试品的抑菌性，还要考察在供试液制备过程中微⽣物受影响的程度（稀释剂对照组）。
2、试验操作⽅法
中国药典2005年版⽆菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法，微⽣物限度检查法包括平⽫法和薄膜过滤法。薄膜过滤法采⽤⼤取样量集菌的⽅法，具有代表性，不易漏检，仪器操作简单；全封闭的过滤系统，避免了操作过程中外源性细菌的污染，对试验结果可信性影响较⼩。故尽量采⽤全封闭的薄膜过滤法。
3、样品的前处理
样品的前处理可采⽤溶解、乳化、破乳、稀释、离⼼等⽅法，也可⼏种⽅法联⽤，但需说明采⽤的处理⽅法的理由，并证明所⽤处理⽅法对各试验菌的⽣长⽆影响。
对⾮⽔溶性的供试品，如果溶解冲洗不完全，会影响试验结果；故应注意使⽤加⼊适量的聚⼭梨酯80或其它适宜的乳化剂和稀释剂，或⽤⼗四烷酸异丙酯处理油类供试品等。 4、⽅法的再验证
建⽴微⽣物学检查⽅法时必须进⾏⽅法学验证，以证明所采⽤的⽅法适⽤于该药品的⽣物学检查。如果产品的组分或原检验条件发⽣改变时，应考察改变对微⽣物⽣长的影响，并进⾏⽅法的再验证；⽬的是考察验证结果的稳定性并及时发现影响微⽣物⽣长的因素。
5、质量标准中【⽆菌】或【微⽣物限度】项下内容的撰写
建⽴微⽣物学检查⽅法时必须进⾏⽅法学验证，并应将验证的⽅法描述在质量标准中【⽆菌】或【微⽣物限度】项下。
⽬前质量标准中【⽆菌】项下常见的描述为：1、取本品，依法检查（中国药典2005年版⼆部附录Ⅺ H），应符合规定；2、取本品，⽤薄膜过滤法处理后，依法检查（中国药典2005年版⼆部附录Ⅺ H），应符合规定。微⽣物限度检查则包含在相应的制剂通则中，描述为“照微⽣物限度检查法（附录Ⅺ J）检查，应符合规定”。
不同处⽅⼯艺制剂的微⽣物学检查⽅法和检验条件不同，只有将经过验证确认可⾏的检验⽅法和检验条件完整描述在质量标准中，实验⼈员才能进⾏⽆菌检查及微⽣物限度检查操作。
质量标准中【⽆菌】或【微⽣物限度】项下应描述经验证试验确定的检验操作⽅法：包括样品的前处理⽅法、步骤，判断有⽆抑菌性的依据，消除抑菌性采⽤的具体⽅法及各⽅法操作的关键点等。
【⽆菌】项下应包括：供试品的制备（包括样品的前处理⽅法）、采⽤的检查⽅法（薄膜过滤法或直接接种法）、采⽤的冲洗液及冲洗量（如采⽤薄膜过滤法），以及标准规定（不得有菌⽣长，应符合规定等）。
对中国药典要求进⾏微⽣物限度检查的制剂，在起草质量标准中微⽣物限度检查时应考虑：（1）微⽣物限度作为检查项单独列出；（2）【微⽣物限度】检查项下应包括：供试品的制备（包括样品的前处理⽅法）、采⽤的检查⽅法（薄膜过滤法或平⽫法、或是⾃然沉降法结合薄膜过滤法、或是低速离⼼法结合薄膜过滤法）、采⽤的冲洗液及冲洗量（如采⽤薄膜过滤法），以及标准规定（细菌数、霉菌和酵母菌数的限度，控制菌不得检出等）。
6、对⽅法验证结果和验证报告的评价
通过所报的敏感菌来验证检查结果的可靠性。
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⾸先应按给药途径确定品种应符合⽆菌检验还是微⽣限度检查，确定验证项⽬。如应进⾏微⽣物限度检查，确定该品种规定的微⽣物限度标准，再确定应验证哪些项⽬。样品的前处理⽅法应合理，并有采⽤⽅法不影响微⽣物⽣长的证据。对供试品的抑菌性、抑什么菌？最敏感菌是那个？应有依据或试验结果来证明；如证明供试品有抑菌性，应验证所选消除抑菌性⽅法的合理性和有效性。判断经验证所确定的检验⽅法和试验条件是否能满⾜最敏感菌的要求。
以上是微⽣物学检查⽅法验证与评价要求，希望与⼤家共同探讨。
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