解剖学研究 2021 年第 43 卷第 1 期 Anat Res, 2021. Vol. 43. No. 1
•论著•
【摘要】目的利用神经示踪技术探讨SD 大鼠长下行脊髓固有神经元及其轴突投射的解剖位置。方法将荧光 金（FG)注射人第I 腰髓（L ,)节段逆行标记大鼠下行脊髓固有神经元（DPNs)胞体；将顺行神经示踪剂生物素葡聚 糖胺（BDA)注射到脊髓第3和第4颈髓处标记此处的DPNs 胞体及其长下行脊髓固有束（LDPT )。固定取材与切片 染后，检测FG 标记的DPNs 胞体在颈髓节段的分布和BDA 顺行标记的LDPT 投射到胸腰髓节段的情况。结果 FG 逆行标记的DPNs 胞体主要分布在颈髓的V II 和V III 板层。BDA 标记的LDPT 主要走行在脊髓白质的两侧和腹 侧，其中第8和第10胸髓(X ^T ,…)白质内BDA 标记的LDPT 轴突指数[分别为（61.丨9±8.6丨）％和（35.55±7.30)%]显 著性高于L ，的（12.05±10.04)%，差异有统计学意义（P<0.05 )。这些被标记的LDPT 轴突主要投射支配胸腰髓IV-X 板层的神经元，其中T ，和T,。脊髓灰质内BDA 标记的轴突数（分别为41.47±20.33和24.87±15.80)显著性多于L ，的 (7.40±4.88)，差异有统计学意义（P<0.05)。结论SD 大鼠的长下行脊髓固有神经元胞体主要集中分布在 颈膨大 脊髓灰质的V D 和W 板层。长下行脊髓固有束轴突可投射支配胸腰髓IV-X 板层的神经元。【关键词】长下行脊髓固有束；生物素葡聚糖胺；荧光金；下行脊髓固有神经元
usb转并口Nerve tracing the anatomical location of long descending propriospinal neurons and their axonal projections in SD rats ZHANG Bao-bao , CEN Xiao-qing , ZEI\G Yuan-shan , DING Ying. Department of Histology and Embryology , Zhong-
shan Medical College t Sun Yat-shan University y Guangzhou 510080, China
axonal projections in SD rats by anterograde and retrograde nerve tracing. Methods
The retrograde nerve tracer Fluoro-
Gold (FG) was injected into the 1st lumbar (Li) segment of spinal cord by stereotaxic apparatus to label the somas of the descending propriospinal neurons (DPNs) in rats. The anterograde tracer biotin dextran amine (BDA) was injected into the cervical enlargement (C 3-C 4) of spinal cord to mark the propriospinal neurons and their long descending propriospinal tract (LDPT) of spinal cord. After 7 days and 14 days, the samples were fixed and sectioned, and then performed the immunofluorescence histochemical staining. The distribution and quantity of FG-labeled DPNs in the gray matt
er of the cervical spinal cord were detected under the fluorescence confocal microscope, and the axonal number and their innervation of BDA-labeled LPDT projecting to the thoracolumbar segment of spinal cord were also detected. Results The FG-labeled DPNs were mainly distributed in the \1 and \T D lamina of the cervical spinal cord, a few FG-labeled DPNs were also found in III-VI and X laminas. The result of statistical analysis showed that there was no statistical difference in the number of DPNs co-labeled by FG and PI among the C 1-C 6 segments of spinal cord. The BDA-labeled LDPT was mainly distributed in both sides and ventral side of the white matter of spinal cord, and the axonal index of BDA-labeled LDPT in the white matter of T8 and Ti0 spinal cord [(61.19±8.61)% and (35.55±7.30)%，respectively] was significantly higher than that in the Li spinal cord (12.05± 10.04)% (P<0.05). The BDA-labeled LDPT axons mainly project to the thoracic spinal cord and innervate the neurons in the IV-X laminas, and a few BDA-labeled axons also project to Li spinal cord and innervate these neurons in the VII-IX laminas of Li spinal cord. The result of statistical analysis showed that the number of BDA-labeled axons in the gray matter of T8 and Ti 〇 spinal cord (41.47±20.33 and 24.87± 15.80, respectively) was significantly higher than that in the Li spinal cord (7.40±4.88) (P<0.05 )• Conclusion
The somas of the Long descending propriospinal neurons were mainly distributed in
张宝宝，岑晓晴，曾园山，丁英
(中山大学中山医学院组织学与胚胎学教研室，广东广州510080)
【Abstract 】 Objective The study investigated the anatomical location of long descending propriospinal neurons and their
基金项目：国家自然科学基金资助项目（8丨774397,81891003) 通讯作者：厂英，
Email:(******************.edu
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the W and \1D lamina of spinal gray matter of the cervical enlargement in SD rats. The long descending propriospinal tract can project to the thoracolumbar segments and innervate the neurons in the IV-X laminas of spinal cord.
【Key words 】Long descending propriospinal tract; Biotin dextran amine; Fluoro-Gold; Descending propriospinal neurons
脊髓固有神经元属于中间神经元的一种，在 颈膨大和腰膨大之间形成下行和上行的脊髓固有 通路1]。研究最多的是下行脊髓固有神经元（Descending propriospinal neurons，DPNs)及其 轴突形 成的下行脊髓固有束，特别是长下行脊髓固有束(Long descending propriospinal tract，LDPT)2] 〇DPNs和LDPT在自发运动和随意运动的产生和调 控中发挥重要的作用3]。研究表明，DPNs和LDPT 的可塑性是脊髓损伤后运动功能重建的靶 点1:3]。本研究主要是利用神经示踪技术〜探讨 Sprague-Dawley(SD)大鼠颈膨大处的DPNs及其 LDPT投射到胸腰段脊髓灰质的解剖位置。这将 为今后研究LDPT轴突再生在大鼠脊髓损伤功能 恢复中的作用提供实验依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物SPF级清洁级健康成年SD雌性 大鼠（体质量200〜250 g)，由中山大学实验动物中 心提供，实验动物许可证号：SCXK (粤）2016- 0029，饲养于中山大学北校区实验动物中心B E，所有实验操作均严格按照中山大学动物管理要求 执行。
1.1.2主要药物与试剂生物素葡聚糖胺（BDA) (10 000 MW, 10%,Invitrogen)、荧光金（FG)(Sig-ma),0.01 m ol/L M S、封闭用山羊血清（北京中衫金 桥），链霉亲和素 555 (Streptavidin 555) (Thermo Fisher)，Hoechst33342 (Sigma)、多聚甲酵（Sigma)和小鼠抗大鼠 MAP2 抗体（Sigma)，
P I(Biofroxx)，羊抗鼠的 488 二抗（Alexa Fluor488)(Life Technologies)，等。
智能对话娃娃1.1.3主要仪器超纯水仪（易普异达）、立体定 位仪（瑞沃德公司）、脊柱固定装置（瑞沃德公 司）、普通离心机（日本久保田制作所）、倒置相差 显微镜（Olympus，日本）、炎光显微镜（Leica，德 国）、激光共聚焦显微镜（Zeiss，LSM800，德国）和微量注射器（Ham ilton company 7000 Series Syringes), 等 〇1.2方法
1.2.1实验动物脊柱固定及脊髓神经示踪部位的 暴露方法SD大鼠给予1%钠腹腔注射 (0.4 m l/100 g)，俯卧固定于实验台，常规消毒，依 次切开皮肤和皮下组织，然后用撑开器展开皮 肤，用剪刀将肌肉沿颈段皮肤向两侧分离，第2 胸椎棘突非常明显，便于识别，根据此棘突向上 逐一定位，然后暴露出第3和第4颈椎的棘突、椎 板和部分侧突，用大鼠脊柱固定装置固定好颈段 脊柱，用咬骨钳咬掉棘突和椎板，暴露颈膨大第3 颈髓（C;)和第4颈髓（C4)节段，在此部位注射顺 行标记物BDA。逆行神经示踪需要暴露第1腰 髓（L J节段，对应脊柱第13胸椎。以第13肋骨 确定第13胸椎的位置，分离肌肉暴露其棘突、椎 板和侧突，用脊柱固定装置固定好第13胸椎，然 后无菌条件下用咬骨钳咬掉棘突和椎板，暴露L，节段，进行FG逆行神经示踪标记。
1.2.2FG逆行神经示踪标记长下行脊髓固有束的 神经元胞体暴露大鼠L，节段后，用虹膜剪小心 剪开硬脊膜，以便注射逆行示踪剂FG。使用一个 被拉至直径30 pm的玻璃针，连接到一个配套的 Hamilto
n微量注射器，将逆行神经示踪剂FG注射 到L，中线左、右分别旁开1mm处。首先使用立体 定位仪确定L，背侧中线为“0”点，然后从脊髓背侧 中线向左、右侧分别旁开1mm，两个注射点分别 注射1 ^1 FG。每个注射点注射深度分别为1.0 mm和1.5mm，即在1.5mm深的位置注射0.5 (Jil后 停留2 min，进而提针到1.0mm的位置再注射0.5 IJ il，停留3 min后拔出玻璃针。注射后逐层缝合肌 肉、筋膜、表皮，并消毒。术后连续3d，每天肌肉 注射1x1〇4U青霉素纳。FG?K踪7d后灌注固定 取材。
1.2.3BDA顺行神经示踪LDPT及其轴突终末投 射的部位暴露大鼠脊髓颈膨大处的(：3和(：4后，用虹膜剪小心剪开硬脊膜，然后在C3和C4背侧中 线左、右分别旁开0.8 mm和1.6mm，脊髓纵向长 轴上相邻两注射点之间相隔2 mm，即共8个注射 点，每个点用携带有玻璃针管的微量注射器注射
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感应门制作0.5 MBDA，注射深度为1mm，停留2 min。注射 后逐层缝合肌肉、筋膜和皮肤，常规消毒和抗炎治 疗，14 d后灌注固定取材。
1.2.4动物灌注固定、取材和切片大鼠给予1% 钠深度麻醉后进行心脏灌注固定：首先 打开胸腔，暴露心脏，用灌注针从左心室心尖部插 人直至主动脉，再剪开右心耳，灌注0.9%生理盐 水约250 ml，再灌注4%多聚甲酵约300 ml，时间 控制在30 min。待灌注过后，迅速取出脊髓，置于 4%多聚甲醛中，41，后固定过夜。随后将后固定 的组织放人20%和30%蔗糖溶液梯度脱水。0CT 包埋颈、胸和
腰段脊髓组织，分别进行脊髓横切或 矢状面冰冻切片，片厚为25 (xm。
1.2.5免疫荧光组织化学法染先将脊髓组织 切片取出，放在37丈烤箱中烤片30 min，以防止组 织脱片。用0.01 m ol/L PBS洗5 minx3次；使用 10%的正常山羊血清进行封闭30 min，然后甩去 血清，不洗，加相应一抗（MAP2)，阴性对照用0.01 m ol/L PBS代替一抗，4丈过夜；第2天先进行复温 处理 30 m in后，使用 0.01 m ol/L PBS洗 5 m in3 次; 弃去PBS后，加人相对应的荧光二抗Streptavidin 555、羊抗鼠的Alexa F丨uor488，于37T温箱中孵育 1h;0.01 m ol/L PBS洗 5 m in 1次；用 Hoechst33342 或PI进行细胞核复染，10 min;0.01 m ol/L PBS洗5 m in3次；防荧光淬灭封片剂封片。
1.2.6神经示踪标记的DPNs及其LDPT的计数分 析在C,~C6节段的横切面上，利用荧光显微镜观 察被FG逆行标记的DPNs胞体在脊髓灰质的板层 分布，并拍照。使用Photoshop软件计数〇(：6节 段被FG与PI染共标记的神经元数量。
在C3和C4注射BDA标记DPNs观察其LDPT 投射到胸、腰段的情况。在脊髓胸、腰段用荧光 显微镜观察BDA标记的LDPT轴突在脊髓白质内 的走行及投射到灰质支配神经元的情况，并利用 激光共聚焦显微镜拍照。使用Photoshop软件在 脊髓横切面上统计LDPT在白质内的数目，以C6白质内被BDA标记的轴突数目作为LDPT的轴突 总和，LDPT从颈段投射到胸、腰段脊髓白质的轴 突数占比以胸、腰段脊髓白质LDPT的轴突指数 表示，即胸、腰段脊髓白质内LDPT轴突指数 (%) = (TS、T,。或L，白质内
BDA阳性轴突数/(：6白质的BDA阳性轴突数）x l〇〇%。LDPT投射到T s、T,。或L，脊髓灰质内的轴突数量也被计数，计数标准为B D A标记的轴突长度>20p m计为1条。1.3统计学分析
数据以均数±标准差表示，应用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析并进行统计学处 理,P<0.05为差异有统计学意义。
母线排2结果
2.1 F G逆行标记的S D大鼠长下行脊髓固有神经元胞体在脊髓颈膨大的解剖位置
在1脊髓节段注射逆行神经示踪剂FG1周 后，观察脊髓颈段被FG标记的DPNs的分布和数 量。结果显示，在颈膨大C3(图1A1~A3)、C4(图川143)和(：5(图1C1~C3)脊髓节段灰质内可见被 FG标记的DPNs胞体（蓝）和PI(红）标记的细 胞核，并可见FG与PI共同标记的DPNs神经元主 要集中在W和W板层，有少数也分布在ID-M和X 板层。C,~C6节段之间被FG和PI共同标记的神经 元（DPNs)数目在C3~C5节段稍微多点，但节段之 间差异无统计学意义（戶>〇.〇5)(图1D)。
2.2 BDA标记的LDPT分布及其在胸、腰段脊髓的投射情况
顺行神经示踪剂BDA被注射人颈膨大处的C3和C4脊髓灰质14 d后，观察颈膨大处的脊髓固有 神经元及其轴突形成的LDPT在胸腰段的投射。结果显示，在C3~T2节段矢状位切片可观察到一个 注射点的
针道，并可见BDA标记的大量LDPT的轴突呈串珠样沿着脊髓白质纵向平行走行并可投 射到灰质内（图2A和图2A1)。在1\节段的横断 面上，可见大量被BDA标记的LDPT主干的轴突 横断面呈点状分布在白质的两侧和腹侧（图2B，82)，并可投射到灰质内1¥~?(板层（图28,81)，多 见于VII和VIII板层（图2B1)。在T9~T I3节段的矢 状位切片上观察到BDA标记的LDPT轴突数比 (：3〜丁2颈、胸髓节段的少。在L，节段横断面上，可 见白质内BDA标记的LDPT轴突数较少（图2C)，并有少量BDA标记的轴突投射到灰质VIII和IV 板层（图2C，C1)。经统计分析显示，在^和丁,。白质内BDA标记的LDPr轴突指数分别为（61.19± 8.61)%和（35.55 ±7.30)%，显著高于L，白质内的 (12.05±10.04)%差异有统计学意义（P<0.05，图2D)。另外，对BDA标记的LDPT投射到T8、T,。和 L，灰质内的BDA阳性轴突数量进行统计分析，结 果显示如图2E，在T8和1',。横切面中可见80八标
4解剖学研究2021年第43卷第丨朗Ana丨〜s. 202丨• V〇l.43. ：\(>.1
图1被F G逆行标记的D PN s胞体在脊髓颈段的分布A l、A2.示被FG 4PI共同标记的丨)PINs胞体在C脊髓节段内的分布；B1、B2•示被FG l.j R共同标记的DPNs胞体在C.，脊髓节段内的分布；(：丨、C2.示被FG勾P丨共同标记的丨)PNs胞体在G脊髓节段内的分布标 尺=100jjun;A3、B3和C3分别为图A2、B2和C2中方框的高倍镜图，示被FG与PI共同标记的DPNs胞体(箭头），标尺=1〇4〇1;0.示在C,-C6脊髓灰质内KG与PI共标的I)PNs细胞数的统计图，n= 5
记的LDPT投射到脊髓灰质内的轴突数（41.47± 20.33和24.87± 15.80)显著多于L，灰质内的（7.40± 4.88 )，差异有统计学意义（P<0.05 )
2.3 BDA标记的LDPT投射到胸腰段支配脊髓神经元的情况
在T«节段横切面上，可见较多的BDA标记的 I.DPT轴突投射到灰质的第III-X板层中（图3AI )，并有BDA标记的LDPT轴突终末（红）与第IX板层内的M A P2 (绿）阳性的神经元胞体相接触形 成类似突触小体的结构（丨?I3A2-A3)。在L，节段 的横切面上，有较少量的BDA标记的LDPT轴突 投射到脊髓灰质内，并且主要分布在第VII、VIII 和IX板层（图3B)，也可见有少M BDA标记的 LDPT轴突终末与MAP2阳性神经元接触形成类似 突触小体的结构（图3B2-B3)。
3讨论
正常脊髓具有传导及调节神经信息等功能，脊髓损伤后中断了大脑与肢体之间的神经环路连 接。本研究团队前期的研究发现全横断脊髓损伤 后皮质脊髓束和脑干来源下行神经纤维的再生十分有限，因此，导致瘫痪的大鼠后肢运动功能恢复 不显著但研究表明脊髓损伤后脊髓同有束的可 塑性和再生能力比皮质脊髓束的更强5:。有研究 发现不完全脊髓损伤后，少量再生的皮质脊髓束 可通过与脊髓残存的固有神经元自发性重组、建 立新的脊髓神经网络，从而“中继”中断的下行信 号6:。近期研究发现，电刺激可激活脊髓固有神 经元合成和分泌神经营养因子，促进脊髓神经元 的内在生长能力7。因此，
脊髓固有神经元及其 形成的同有神经通路对于脊髓损伤后的运动感觉 恢复是十分重要的，也是脊髓损伤的重要治 疗靶点。0前国内外研究小鼠脊髓固有束的解剖 位置和脊髓固有束再生的研究比较多，但对SD大 鼠的脊髓固有束的研究相对较少故本研究利用 顺行和逆行神经示踪技术探讨正常S D大鼠脊髓 颈膨大处的DPNs及其形成的LDPT投射到胸腰 段脊髓的解剖位置，这将为今后探索脊髓损伤的 策略—
—促进LDPT的再生提供了重要的基 础资料
神经示踪在神经科学领域研究中具有举足轻 重的作用，顺行示踪剂BDA
在观察神经纤维的结李德金后台
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图2 BDA顺行标记的LDPT在脊髓内的分布和投射情况 A和A1.示BDA标记的下行长脊髓固有束（LDPT)的轴突（红，箭头）在0：3-乃节段的矢状位纵切面上的分布，A1为图A方框的放大图。A标尺= 100 pm，A1标尺=20 pm。B和C.分别示BDA标记的 LDPT轴突在脊髓1和乙横切面上分布情况，标尺= 100 B1和B2分别示B图方框内的高倍镜下T8节段灰质(B1)和白质(B2)内的投射情况，标尺=20 pm。C1和C2.示C图方框内的高倍镜下1节段灰质(C1)和白质(C2)内的投射情况，标尺=20 fxm:D.示在T8、T1(，和L，白质 内BDA标记的LDPT轴突指数的统计柱形图/P<0.05，n= 5 E.示BDA标记的LDPT投射到TS、TI U和L，灰质内的轴突数量的统计柱形 图，*尸<0.05，n= 5
构及其走行方面有其独特的优势，BDA在细胞外 注射后，可以被神经元及其突起摄取，然后沿轴突 转运至远处，常用来研究神经元的轴突走行和投 射8]。FG为脂溶性染料，一般用于逆行标记，通 过慢速轴浆运输逆向标记，主要标记神经元的胞 浆，细胞核不着，在胞浆的存在不超过3周，它 被紫外光激发呈蓝:9]。
压电陶瓷超声换能器有研究发现在大鼠脊髓损伤后，脊髓固有神 经元表现出轴突再生的倾向，它们可以再生并延 长轴突投射，在脊髓损伤区头、尾端重建连接修复 神经环路:1°]。本研究将FG示踪剂注射入L，节段 逆行标
记大鼠DPNs胞体的解剖位置，结果发现，凡是轴突投射到L，注射部位的颈、胸段DPNs胞体 都可以被FG逆行标记。在颈膨大处FG逆行标记 的DPNs胞体主要集中在VII、VIII板层，这结果与 文献报道的大小鼠的LDPT神经元胞体位置基本相符11:。另外，本文将BDA顺行示踪剂注射于大 鼠C，和C4处，标记此颈髓节段内的脊髓固有神经 元及其轴突形成的LDPT，可见LDPT主干平行走 行在脊髓白质内，并可投射到胸、腰髓节段灰质 内，支配IV~X板层内的中间神经元与运动神经元。
许多动物实验研究已证实脊髓固有神经通路 介导和维持各种正常的脊髓功能，并且通过不同 措施可促进脊髓固有束的再生来介导脊髓损 伤后的功能恢复。目前越来越多的研究表明，激 活DPNS的再生能力，有利于恢复损伤脊髓的运动 功能，比如生长相关基因的过度表达或神经营养 因子（如BDNF和NT-3等）的应用可以促进脊髓固 有神经元的再生312]；也有研究报道，在成年小鼠 T,。砸伤后，将携带转录因子Kmppel样因子7 (KLF7)的腺相关病毒注射到损伤部位上方
的
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