•病理学的发展与使用的工具 和方法的更新密切相关： 解剖刀剪等—进行尸体检查—器官病理学
电子显微镜—发展—超微病理学
分子生物学—带动—分子病理学
计算机及网络—走进—信息病理学
病理学技术就是如何应用新工具的方法和措施。
从发展过程看，在新工具面前必须首先解决使用的技术及其相应措施，才能在理论上有所发现。所以，我们必须关注那些新工具、新方法，才能得以用于解决病理学中的问题。
病理学技术包括传统病理学技术和现代新技术
•传 统：Formalin固定，石蜡切片和HE染及特殊染技术—病理学的基本技术。
人脸识别安装方法•新技术：免疫组化、原位杂交、原位PCR、凝胶电泳技术 、核酸杂交技术（包括FISH、CGH） 、 PCR技术 、基因重组技术、基因测序技术、细胞凋亡检测技术、细胞培养技术、流式细胞技术、激光共聚焦、显微切割技术、组织芯片技术、DNA芯片技术等等。
•根据科研和临床病理诊断的需要，不断建立和开展新技术，把传统技术和新技术相结合，不断提高病理学技术水平，逐步与国际水平接轨。
常规病理技术
•近20余年来，常规病理技术也得到较大发展：
微波方法缩短组织脱水、浸蜡时间；
新的化学试剂取代传统的甲醛、二甲苯；
逐步向自动化发展（全自动封闭式组织脱水机、全自动染封片系统、全自动特殊染机等）
细胞病理学技术 ：传统的涂、刮片逐步向
薄层液基细胞学发展
TCT 液基细胞学检测
新柏氏超薄细胞检测仪
特殊染技术
•HE染虽是一种快捷、经济、且易于掌握的方法，但它不能回答病因学、组织发生及发病机制等许多方面的问题。为了显示与确定组织或细胞中的正常结构或病理过程中出现的异常物质、病变及病原体等，需要分别选用相应的显示这些成分的染方法进行染，固称特殊染。
•在过去的20年里，由于免疫组织（或细胞）化学技术的迅速发展与广泛应用，特染的应用日趋减少，人们感到以组织化学为基础的特染方法似乎有些过时，但实际上它在诊断病理学及研究中仍然有着不可忽视的作用。
特殊染的方法很多，常用的一些特殊染的方法介绍如下：
1、网织纤维染（reticulin stains）
显示网织纤维及基底膜物质。传统的网织染以银染为基础，有Gomori法,Wilder及Gordon和Sweet法等，
它们在肿瘤病理诊断中具有鉴别诊断作用：
1）区别上皮与非上皮肿瘤；
2）区别某些间叶组织肿瘤；
3）区别原位癌与浸润癌。
2、PAS染 (periodic acid-schiff)
可以显示糖原、中性粘液物质、基底膜、霉菌与寄生虫。
3、微生物特染
最常用者是革兰氏阳性及革兰氏阴性细菌染法（B&B）、分枝杆菌染、霉菌染。
4、嗜银及亲银染 不需外加还原剂，在黑暗中即有还原银盐的能力，称为亲银性(argentaffin),代表方法Fontana-Masson法。而需外加还原剂或在光线存在时才有还原能力，称为嗜银性（argyrophilic）, 代表方法是非改良的Grimelius法。
5、淀粉样染 刚果红（congo red）是最可靠且实用的检测淀粉样物质的方法。
6、三染（trichrome stains） 可分别显示细胞核、细胞浆及细胞外胶原。
7、磷钨酸苏木素染（PTAH染）
一种三染的特殊类型，用于显示肌组织及胶质细胞胞浆内的微丝。
8、含铁血黄素、黑素及钙染 显示含铁血黄素首选Perls普鲁士兰反应(Prussian blue)。
Fontana-Masson 法是用含氨盐溶液显示黑素的方法。在显示钙的染中，von Kossa 法常用。
9、中性脂质染 油红（Oil red）是最常用的染方法，但不能用于石蜡包埋的组织。中性脂质（lipids）最常用于肿瘤的诊断与鉴别，可区别卵巢纤维瘤及泡膜细胞瘤、皮脂腺癌与鳞状细胞癌等。
10、粘液染（mucin stains） 粘液染法中，阿尔辛蓝(Alcian blue)和PAS联合可显示中性、轻度酸性及高度酸性粘液物质，故是最好的全粘液(pan- mucin)染法。
11、 Giemsa染 常用于涂片及切片染。可清楚的显示并区分不同分化阶段的淋巴造血细胞，并可将肥大细胞浆染成紫红颗粒，故在上述瘤性及反应性增生的诊断中有重要作用。
12、 髓鞘（myelin）染 分正常髓鞘染和变性损伤髓鞘染。最常用的方法为Luxol坚固蓝(Luxol fast blue)法。
13、 弹性纤维（elastic fibers）染 最常用Weigert法及 Verhoeff van Gieson (VVG) 法，
一般认为前者特异，后者快速且清楚。
实践篇
准备阶段
•（一）抗体购买
试剂公司的选择
•北京中杉、福州迈新
•Leica、BioGenex(北京英硕力代理)、Santa Cruz （北京中杉代理）
•上海太阳、上海长岛
•武汉博士德、北京博奥生
•（二）组织处理
1、组织要新鲜
冰冻切片离体后尽快冻存
石蜡切片要尽快固定
2、主要病灶区取材
3、组织块V：1×1×0.2cm
•（三）标本固定
1、10％的中性福尔马林为常用的固定剂，对蛋白损伤少，能保存大部分组织结构。
2、固定时间6－12小时，以不超过48小时为宜。
3、固定液的量一般应为组织块总体积的4~5倍,也可达15~20倍。
（四）脱水、透明、包埋
1、脱水透明室温条件即可。
2、 浸蜡包埋温度根据蜡的熔点确定（60－70度）。
（五）载玻片处理与切片制作
1、新载玻片硫酸浸泡过夜，流水冲洗，蒸馏水洗涤，置37℃温箱内烘干。
2、将载玻片浸入现配的1：50APES丙酮液1分钟，入纯丙酮溶液洗除未结合的APES，自然晾干。
3、切片厚度3－5μm，65℃温箱烤片2－4小时。
操作阶段
•热修复：高压、微波等
•双暴露：酶+热修复
抗体浓度
常用0.01mol/L pH7.4 的PBS 或TBS 缓冲液作抗体稀释液。 选择最佳 一抗、二抗稀释浓度。
对照选择
•用PBS液代替一抗做阴性对照；
•用已知阳性的组织切片做阳性对照。
证明和肯定阳性结果的特异性， 排除非特异性疑问。
结果判断
特异性反应产物 常分布于特定的部位，如胞浆内，也有分布在细胞核和细胞表面的，即具有结构性。 特异性染表现为在同一切片上呈现不同程度的阳性染结果。
非特异性染 表现为无一定的分布规律，常为某一部位成片的均匀着，细胞和周围的结缔组织均无区别的着 。常出现在干燥切片的边缘，有刀痕或组织折叠的部位。
免疫组化结果的判断原则：
•1、必须设对照
•2、抗原表达必须在特定部位
•3、阴性结果不能视为抗原不表达
•4、免疫组化与HE切片诊断应
以HE切片诊断为准
细胞浆阳性表达
膜阳性表达
细胞核阳性表达
提高IHC方法敏感性的辅助手段
免疫组化染过程中存在的问题、
原因分析及对策
• 无片（即无阳性信号）
• “杂音”染片（有阳性信号）
1、 全片着
2、 切片边缘着
3、“阴阳脸”着
4、 灶片状着
5、 间质着
6、 细胞浆着
7、 细胞核着
免疫组化染影响因素
•影响免疫组化染质量的因素有很多，在实验中应注意组织的取材和固定，选择质量好的商品化抗体，恰当地选择和使用封闭和抗原修复手段，严格的技术操作和对照等。
•注意组织的取材和固定
•假阴性问题
•假阳性问题
免疫组化自动染仪
分子病理学相关技术
•原位杂交
•荧光原位杂交(FISH)
•多聚酶链式反应技术（PCR）
• 原位PCR
•显微切割技术（micro-dissection）
•基因测序技术
•生物芯片技术
消音材料Southern印迹杂交法
•1975年首先由苏格兰爱丁堡大学Southern报告
•1981年Korsmeyer等首先将其应用于基因重排
•其原理是：两条单链DNA碱基可与人工合成的互补单链DNA探针相结合（一般用同位素标记）。
原位杂交
• 原位杂交(in situ hybridization，ISH)是核酸分子杂交的一部分，是将组织化学与分子生物学技术相结合来检测和定位核酸的技术。根据所选用的探针和待检靶序列的不同，有DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交和RNA-RNA电动车太阳能充电器杂交。
原位杂交技术的应用
•①细胞特异性mRNA转录的定位，可用于基因图谱、基因表达和基因组进化的研究；
•②感染组织中病毒DNA／RNA的检测和定位，如EB病毒mRNA、人乳头状瘤病毒（HPV）、乙型肝炎病毒(HBV)和巨细胞病毒DNA的检测；
•③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测；
连卷背心袋•④基因在染体上的定位；
虚拟传真•⑤检测染体的变化，如染体数量异常和染体易位等；
•⑥分裂间期细胞遗传学的研究，如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定，某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定等。
HPV原位杂交结果
HPV原位杂交结果
HPV原位杂交结果
原位杂交和免疫组化染技术比较
•IHC使用的是抗体，其检测对象是抗原，机制是抗原—抗体的特异性结合，是蛋白质表达水平的检测；
•ISH使用的是探针，遵循碱基互补配对的原则与待检靶序列结合，是DNA或mRNA水平的检测。
荧光原位杂交
(fluorescence in situ hybridization，FISH)
用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染体上是沿着染体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染体进行杂交从而将特定的基因在染体上定位。
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