176
㊀2021Vol.47No.3(Total 423)
DOI:10.13995/jki.11-1802/ts.025010
引用格式：陈威风，陈薇，蔡颖，等.基于核酸适配体结合纳米金模拟酶用于单增李斯特菌的快速检测[J].食品与发酵工业,2021, 47(3):176-180.CHEN Weifeng,CHEN Wei,CAI Ying,et al.Rapid detection of Listeria monocytogenes by nucleic acid aptamer combined with nano-enzyme[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(3):176-180.
基于核酸适配体结合纳米金模拟酶用于单增李斯特菌的快速检测
陈威风1，陈薇1，蔡颖1，崔丽伟1，郝修震1∗，王小红2∗
1(河南牧业经济学院，河南郑州,450046)
2(华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉,430070)
摘㊀要㊀利用纳米金模拟酶在一定条件下能够催化过氧化氢氧化3,3ᶄ,5,5ᶄ-四甲基联苯胺发生颜反应，同时结合特异性高㊁亲和力强的核酸适配体建立了单增李斯特菌快速检测方法㊂通过对实验条件进行优化，建立了单增李斯特菌浓度与特定波长下吸光度值之间的关系式㊂线性回归方程为y =0.0321x +0.0248,R 2=0.9963，检出限约为5CFU /mL ，实际样品测定的回收率为93.5%~105.4%，相对标准偏差小于10%㊂该文方法特异性强㊁操作简单㊁成本低，能快速对食品中单增李斯特菌进行定量检测㊂关键词㊀单增李斯特菌；核酸适配体；纳米模拟酶 第一作者：博士，讲师(郝修震教授和王小红教授为共同通讯作者,E-mail:hnmyjjxy@163;wxh@mail.hzau.edu)
基金项目：河南牧业经济学院博士启动经费项目(51000961)；国家重点研发计划课题项目(2017YFC1600105)；河南省科技攻关项目(182102110303;202102110058)
收稿日期:2020-07-09，改回日期:2020-09-11
㊀㊀单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocyto-genes )是一种能够引起人类㊁家畜共患病的食源性致病菌，具有较强的致病性并广泛分布于人类生存环境
中，如土壤㊁植物㊁水㊁乳制品㊁肉制品㊁蔬菜制品等㊂免疫力低下人(婴幼儿㊁孕妇㊁中老年人)容易接触并感染，进而引起呕吐㊁脑膜炎㊁孕妇流产㊁败血病等症状，致死率高达30%[1-3]㊂单核细胞增生李斯特氏菌在较低的温度下也能正常生长，从而增加了感染食品的机会，其危害对于冷冻食品而言较为突出[4-5]㊂单增李斯特菌可形成生物膜，在食品加工设施表面定居，也能在强酸强碱环境中生存㊂此外，土壤中的单增李斯特菌是一种腐生菌，以腐烂的有机物为食，同时也增加了果蔬污染的风险[6]㊂
目前，我国食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检
干电池手机
测主要采用分离和培养方法，并结合相关的显介质，但存在操作复杂，实验周期长等问题[7]㊂近年来，基于抗体的免疫学方法[8-9]㊁PCR [10-11]㊁
LAMP [12-13]和分析MIC 模式的VITEK2系统[14]方法等已经建立，但都具有局限性㊂抗体㊁ELISA 试剂盒和RT-PCR 试剂昂贵，缺乏成本效益，而VITEK2系统既复杂又耗时㊂因此，迫切需要开发更简单㊁快速的方法用于单增李斯特菌的检测㊂
核酸适配体是在体外合成得到的一小段DNA 或RNA 链㊂近年来，许多目标物的适配体通过指数富集配体系统进化技术在体外进行多轮筛选㊁扩增㊁富集得到[15-16]，是一个相对稳定㊁分子质量小的化合物，易于修饰，可在体外无限合成，具有高特异性和强亲和力等优点㊂基于该优点，核酸适配体得
到了快速发展，在食品检测中应用广泛，如沙门氏菌[17]㊁黄曲霉毒素[18]㊁重金属离子[19]和瘦肉精[20]等的检测㊂本文根据适配体的高度特异性，利用适配体与目标物㊁纳米金(gold nanoperticle,AuNP S )的相互作用及纳米酶催化过氧化氢氧化3,3ᶄ,5,5ᶄ-四甲基联苯胺(3,3ᶄ,
5,5ᶄ-tetramethylbenzidine,TMB)发生颜反应，建立单增李斯特菌快速检测方法，并对方法的准确度㊁精密度进行评定，为单增李斯特菌快速测定提供新思路㊂
1㊀材料与方法
1.1㊀材料与试剂
猪肉样品，当地超市;TMB，郑州莱宝实验器材科技有限公司；过氧化氢(H 2O 2)㊁十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)㊁氯金酸，国药集团化学试剂有限公司；所用实验试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水㊂单增李斯特菌序列:5ᶄ-ATCCATGGGGCGGAGATGAGGGGGAGGAG-GGCGGGTACCCGG-3ᶄ[21]
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㊀1.2㊀仪器与设备
BlueStar B 紫外-可见分光光度计，北京莱伯泰科
仪器股份有限公司;AE224电子分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司;ULUP-I-10T 超纯水仪，四川优普超纯科技有限公司㊂1.3㊀AuNP S 的合成
采用氧化还原反应，利用柠檬酸盐还原氯金酸的方法制备AuNP S [22-23]㊂向250mL 的三口烧瓶中加入98mL 超纯水和1mL 10g /L 氯金酸溶液，于集热式恒温加热磁力搅拌器上，设置温度为120ħ，加热至沸腾后，向圆底烧瓶中迅速加入1mL 10g /L 柠檬酸钠溶液，观察溶液颜由淡黄到灰黑至紫红最后变为酒红，继续搅拌，保持溶液沸腾15min㊂停止加热，继续搅拌冷却至室温，将制备的AuNPs 溶液于4ħ冰箱贮存备用㊂1.4㊀单增李斯特菌的检测过程 向反应体系中先加入30μL 1.0μmol /L 单增李斯特菌适配体和20μL 不同浓度的菌液充分混合15min，然后加入50μL 的AuNPs 溶液，充分混合振荡15min 后，加入20μL 50μg /mL 的CTAB 溶液，继续振荡
15min，随后分别加入60μL 具有还原性的模拟酶底物TMB 和20μL 体积分数为30%的H 2O 2溶液，在37ħ培养箱中充分反应45min 后，肉眼观察颜变化并对其在450~750nm 范围内进行吸光度扫描，记录其在最大吸收波长650nm 处的吸光值，并计算各个L.monocytogenes 浓度下吸光度的差值(ΔA =A 0-A LM ,A 0为溶液中不添加L.monocytogenes 时的吸光度值,A LM 为
溶液中添加LM 时的吸光度值)㊂1.5㊀实际样品测定
为验证该检测体系在食品中应用的可行性，称取25g 猪肉样品，配制3个连续稀释度(2.6ˑ102㊁2.6ˑ103和2.6ˑ104CFU /mL)的单增李斯特菌菌液，吸取1mL 加入至猪肉样品中拍打均匀，放入盛有225mL
的无菌生理盐水的均质袋中，用均质机拍打1~2min，混匀㊂根据已建立的检测方法，加入反应体系中进行检测，同时倒平板涂布，至37ħ培养箱培养18~24h，验证平板培养计数结果，计算回收率㊂2㊀结果与分析
2.1㊀紫外吸收光谱表征
利用紫外-可见分光光度计对比法检测L.monocytogenes 的可行性进行考察㊂在反应体系中不添加H 2O 2和TMB，研究AuNP S 在反应过程中的分
散状态，结果如图1-a 所示㊂对比曲线a㊁c 可知，测定体系中无CTAB 时,AuNPs 颗粒具有较强的表面等离子共振特性，在溶液中呈现分散状态，呈红,520nm 处有吸收峰，证明单增李斯特菌的存在不影响溶液状态的变化；当加入CTAB 后，吸收峰从520nm 移至740nm(曲线b)，颜呈浅蓝，证明此时AuNPs 颗粒发生了聚集；加入适配体后溶液颜变为红，在520nm 处重新出现吸收峰(曲线d)，说明此时AuNPs 颗粒重新呈现分散状态；而加入L.monocyto-genes 后,740nm 又重新出现了吸收
峰(曲线e)，颜又变为浅蓝，这说明AuNPs 颗粒又发生了聚集㊂在反应体系中加入H 2O 2和TMB，研究单增李斯特菌浓度与反应体系颜变化的关系，如图1-b 所示,AuNPs 可催化H 2O 2氧化TMB 出现蓝，在650nm 处有吸收峰(曲线a)，对比曲线a 和b 可以看出单增李斯特菌适配体可以增强AuNPs 催化能力，催化溶液显示深蓝㊂对比曲线a 和c 可看出CTAB 可诱导AuNPs 发生聚集，在650nm 处吸光度降低，溶液呈现浅蓝㊂对比曲线d 和e 发现，当反应体系存在L.monocytogenes 时，溶液颜变浅，吸光度值下降，这是由于L.monocytogenes 与适配体特异性结合,AuNP S 失去了适配体的 保护 作用，催化能力降低㊂此外，在无
TMB(曲线f)或无AuNPs(曲线g)情况下，均不产生催化反应，溶液呈无，实验结果与上述结论一致㊂
a-不添加H 2O 2和TMB 的反应体系;b-添加H 2O 2和TMB 的反应体系
图1㊀不同条件下反应溶液的吸收光图谱Fig.1㊀The absorption spectra of the reaction solution
under different conditions
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㊀2021Vol.47No.3(Total 423)
2.2㊀实验条件优化
为了提高准确度和灵敏度，在单增李斯特菌浓度为1.47ˑ104CFU /mL 时对实验条件进行优化㊂本实验对溶液中单增李斯特菌适配体浓度㊁CTAB 质量浓度㊁TMB 用量㊁H 2O 2用量和反应时间进行优化，探讨不同条件下吸光度差值的变化，寻求最佳实验条件㊂
当DNA 适配体浓度过低时,DNA 适配体不能完全阻止CTAB 对AuNPs 模拟酶活性的团聚作用，而当D
NA 适配体浓度过高时,DNA 适配体会与L.monocytogenes 特异性结合，未结合完的DNA 适配体会与CTAB 作用，从而减小了CTAB 对AuNPs 的团聚
作用，故本实验选择1.0μmol /L 为最佳的DNA 适配体浓度(图2-a)㊂由图2-b 可知,CTAB 最佳质量浓度为50μg /mL，这可能是由于CTAB 质量浓度过低时，其对AuNPs 的团聚作用较小，而过高时，适配体的加入不足以改变CTAB 对AuNPs 的作用力，使检测体系的灵敏度下降㊂TMB 和H 2O 2用量直接影响反应体系的氧化程度，从而导致吸光度值的变化，影响测定灵敏度㊂根据实验结果(图2-b㊁图2-d)，选择TMB 和H 2O 2的最佳用量分别为为60μL 和20μL㊂如图
2-e 所示，随着反应时间的增加，吸光度差值呈现先增后降的趋势，故本实验选择45min 为最佳反应时间㊂
a-适配体浓度;b-CTAB 质量浓度;c-TMB 用量;d-H 2O 2用量;e-反应时间
图2㊀实验条件的优化
Fig.2㊀Optimization of experimental conditions
2.3㊀线性范围与检出限
随着单增李斯特菌浓度的不断增高，最大吸收值不断降低，溶液颜依次变浅；以最大吸收波长处吸光度变化值为纵坐标,L.monocytogenes 浓度对数为横坐标，绘制相关性曲线，如图3所示，线性方程为y =0.0321x +0.0248,R 2
=0.9963，检出限约为5
CFU /mL㊂与传统培养法相比，该可视化检测体系对单增李斯特菌有较灵敏的检出限，检测时间为1.5h，在检测时间和操作程序方面有绝对优势㊂与GRADY 等[24]基于RT-PCR 建立的单增李斯特菌检测方法相比，检出时间更短，而且不依赖昂贵的仪器，就可实现可视化检测㊂与LIU [25]开发的基于表面增强拉曼散射结合重组
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)
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㊀酶聚合酶扩增检测单增李斯特菌的方法相比，检测时间更短，检出限更低，而且不需要繁琐的操作步骤㊂
a-光谱图;b-校准曲线
图3㊀不同浓度的L.monocytogenes 吸收光谱图和校准曲线
Fig.3㊀The absorption spectra togenes with different concentrations and the calibration curve
2.4㊀特异性研究
为了验证可视化检测L.monocytogenes 的特异性，在最佳条件下，将不同浓度的L.monocytogenes 菌液分别替换成浓度为1.47ˑ103CFU /mL 的金黄葡萄球菌菌液Staphylococcus aureus ㊁沙门氏菌菌液Sal-monella ㊁福氏志贺菌菌液Shigella flexneri ㊁大肠杆菌菌液Escherichia coli 和枯草芽孢杆菌菌液Bacillus subtilis 进行特异性实验㊂由图4可知
，当L.monocytogenes 存在时，适配体会与其特异性结合，溶液的吸光度值明显低于其他5种菌在反应体系溶液中的吸光度值，表明所建立的方法特异性较好㊂
图4㊀可视化检测L.monocytogenes 的特异性分析Fig.4㊀Visualization specificity analysis togenes
2.5㊀实际样品检测
为验证该检测体系在食品中应用的可行性，本实
验选取猪肉样品进行验证，结果如表1所示，样品回收率为93.5%~105.4%，由此表明所建方法可以实现对单增李斯特菌进行准确㊁快速测定㊂
表1㊀猪肉样品中单增李斯特菌的检测
Table 1㊀Detection togenes in pork samples
样品添加量/
(CFU㊃25g
-1
)回收量/文具盒生产过程
(CFU㊃25g
-1
)
回收率/%RSD /%Pork1 2.6ˑ104
2.67ˑ104
102.7 2.2Pork2 2.6ˑ103
2.74ˑ10
无框画3
105.4 4.8Pork3
2.6ˑ102 2.43ˑ102
93.5
7.0
3㊀结论
本实验以金纳米粒子作为比探针，以核酸适配体为生物识别元件，构建了一种灵敏度高㊁特异性强的可视化快速检测方法㊂在最佳实验条件下，建立了可视化检测L.monocytogenes 的快速定量标准曲线,
线性方程为y =0.0321x +0.0248(R 2=0.9963)，检出限约为5CFU /mL㊂加标回收率为93.5%~
105.4%，标准偏差小于10%㊂所建方法操作简单，可在2h 内根据溶液颜变化实现对单增李斯特菌的快速检测，结果准确可靠㊂
参
考
文
献
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combined with nano-enzyme CHEN Weifeng 1,CHEN Wei 1,CAI Ying 1,CUI Liwei 1,HAO Xiuzhen 1∗,
WANG Xiaohong 2∗
1(Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450046,China)
2(College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)
ABSTRACT ㊀A method for rapid detection of Listeria monocytogenes was established using color reaction of H 2O 2-oxidized 3,3ᶄ,5,5ᶄ-tet-
ramethylbenzidine (TMB)catalyzed by gold nano-enzyme,combined with high specific and affiliative aptamer.Under optimized experimen-
tal conditions,the linear regression equation describing the relation between concentration togenes and absorbance at a specific wavelength was determined and expressed as y =0.0321x +0.0248(R 2=0.9963).The detection limit was calculated as 5CFU /mL,the sample recovery rate was 93.5%-105.4%,and the relative standard deviation was less than 10%.In summary,the method has the advan-tage of strong specificity,simple operation,and low cost,and can be used for rapid quantification togenes in foods.
Key words ㊀Listeria monocytogenes ;nucleic acid aptamer;nano-enzyme
豫公网安备41160202000603
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