金属接线盒甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，调节基因的表达和关闭，在细胞正常发育、基因表达模式以及基因组稳定性中起着至关重要的作用，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。 目前甲基化特异性PCR ,Methylmion Specific PCR，简称MSP，及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法．原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行PCR扩增，通过检测，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。MSP法灵敏度较高，应用范围广。 实验前准备
在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂，如：3mmol NaOH，DNA 纯化试剂盒，以及PCR检测用到的试剂盒等。
所涉及的仪器和耗材有赛默飞公司提供的单道移液器、QSP盒装吸头、Nun 冰盒，Thermo Scientific全波长扫描式多功能读数仪，还有常规的离心机、水浴锅等。led发光棒
本实验的操作流程为：引物设计，重亚硫酸盐修饰后进行DNA纯化，通过浓度检测方进行甲基化特异
性PCR检测。
黑磷化
首先进行引物设计
甲基化常发生在启动子区，以DAPK1基因甲基化引物设计为例来。
首先要到DAPK1的启动子区，登陆Map Viewer，搜索DAPK1。点击gene,filter，到对应的基因，获得更多的信息。点击Map Viewer，可见DAPK1在9号染体的具体位置。第一个外显子位于90140 kb处，估计启动子就在其上游2000kb内。显示为Genbank格式，点击display，获得序列。
将得到的序列拿到Promoter Scan中预测，获得该启动子的相关信息。预测结果的可靠性，需要通过实验证实。
最后，登陆在线引物设计程序“MethPrimer”，将序列复制到框中，这选项是设计BSP引物，可根据需要设置参数。我们选择MSP引物，点击Submit获得MSP的5对引物。一般选择第一对引物进行实验。
重亚硫酸盐修饰
加1.0μl 3 mmol NaOH溶液到装有10μl DNA的PCR管中，DNA浓度一般为1ng-1μg，漩涡混匀。在37℃条件下孵育10min。加入120μl新鲜配制的DNA Modification Reagent，漩涡混匀。70℃孵育40min。
DNA纯化
温育结束，立即加入500 μl DNA Binding Buffer，混合均匀。
调制解调器固件
将Modified DNA Purification Column放置到2 ml的Collection Tube中，加入修饰好的DNA样品到柱中，静置2min。11000×g离心1min，弃滤液。
加700μl DNA Wash Buffer到柱中，11000×g离心1 min，弃废液。
加200μl新选配制的Desulfonation Solution到柱中，室温静置15min。11000×g 离心1 min，去除流出液。
加700μl DNA Wash Buffer，11000xg离心1 min，弃滤液。
重复用700μl DNA Wash Buffer洗离心柱，离心弃除滤液。再次离心1min，去除残留的DNA Wash Buffer。
将离心柱放置在新的1.5ml的离心管中，加入25-50μl经过65-70℃预热的DNA Elution Buffer，静置1min后离心1min。收集得到的DNA可立即进行分析或存储于-20℃冰箱备用。
DNA浓度检测
本实验通过Thermo Scientific 全波长扫描式多功能读数仪进行DNA的纯度和浓度检测。在定量模块上点上双蒸水作为空白对照和上述实验中纯化得到并已稀释过的DNA，设置两个重复。将定量模块放入读数仪中进行浓度检测。编辑样品孔后，设置测量230、260、和280nm的吸光值。点击连接，待机器运行后，查看260/280和260/230的值，并计算DNA浓度以便进行后续实验。
甲基化特异性PCR检测
使用甲基化引物进行PCR扩增：按照下列组分配制反应体系：Taq 酶0.5μl，dNTP 0.5μl，甲基化上游引物1μl，甲基化下游引物1μl，10× buffer 2μl，模板2μl，水13μl。实验中，需设置甲基化阳性对照、未甲基化阳性对照和空白对照。
留言板制作
体系配制好后，瞬时离心，放入PCR仪中，设置95℃预变性10min，94℃
变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，40个Cycles，72℃延伸10min后4℃保存。
使用非甲基化引物进行PCR扩增：同样的，安照上述方法配制好体系后，将PCR管瞬时离心，放入PCR仪中反应。
反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测。在凝胶扫描仪中查看结果。
结果分析
通过电泳检测，空白对照组没有扩增条带，阳性对照和实验组都呈甲基化阳性，且阳性条带在140bp左右，和预想的结果相符。
疑问解答
实验结束，现在进入疑问解答时间。
Doctor A，甲基化实验的引物设计和一般的引物设计有什么区别吗？
ok，在甲基化特异性PCR 反应时，需要设计两套不同的引物对：一对引物针对经亚硫酸盐处理后的甲基化DNA 链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点发生了甲基化；另一引物针对经亚硫酸氢钠处理后的非甲基化DNA 链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点没有甲基化。
引物必须包含几个CpG岛以区别甲基化和未甲基化的DNA, 以避免甲基化引物扩增未甲基化模板，并且还要能区分亚硫酸盐修饰前后的DNA 序列, 以避免扩增处理不完全的DNA。
甲基化引物设计需要大家多花时间和精力去摸索，其设计原则，本教材的PDF中也有相关资料，大家回去好好了解，多多交流。
谢谢Doctor，那怎样保证亚硫酸盐修饰成功？
修饰DNA的目的是将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。影响此过程的主要因素有修饰试剂的浓度、反应温度、反应环境的pH值及反应时间。其中任何一个环节出现问题都将导致MSP 扩增失败。根据经验，首先亚硫酸盐的浓度最好控制在3-3.9mol/L为好，其pH 值必须用NaOH精确调整至5.0。其次，修饰时间要掌握好，修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化成尿嘧啶且DNA模板破坏加剧，而时间过短会导致修饰不彻底。DNA模板量应控制在不超过2μl为宜。
遵循以上几点基本上能保证大部分的未甲基化的胞嘧啶转化尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。但是，此修饰过程中模板DNA会被降解。当DNA样品较少时，在纯化回收时可加人适量鲑鱼精DNA作为载体，有利于DNA沉淀。
吸油烟机止回阀
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议