火漆印章头如何自制
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在 3 小时内完全转化富含 GC的 DNA. 两次加热变性的反应步骤简化了由未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的过程 . 没有DNA 沉淀.并且通过柱层析一步完成DNA的纯化和脱硫.洗脱的超纯 DNA 对于一系列的分子生物分析是非常理想的。
描述
EZ DNA Methylation-Gold KitTM 是我们 EZ DNA Methylation Kit产品的改进版. EZ DNA Methylation-Gold Kit 将 DNA 变性过程和亚硫酸氢盐转变过程转化为一步.此步骤采用温度变性来取代以前方案中使用氢氧化钠的化学变性过程. 经过DNA亚硫酸氢盐转变,试剂盒可大量回收到 DNA .两种试剂盒都是基于在胞嘧啶与亚硫酸氢钠之间发生的使胞嘧啶转变为尿嘧啶的三步反应. EZ DNA Methylation-Gold 与 EZ DNA Methylation Kits 都采用创新的柱内脱磺酸技术来减少不必要的DNA沉淀步骤以便每次都可以提供给研究人员较好的结果.试剂盒的设计可以减少模版降解和纯化过程中的DNA损失, 并且完全转化未甲基化的胞嘧啶.回收的DNA 对于PCR扩增、限制性内切酶消化、测序、微阵列等下游分析是很理想的. 右图是 EZ DNA Methylation-Gold Kit所呈现出的结果.
在经过亚硫酸氢盐处理后的DNA 测序结果. 使用EZ DNA Methylation-Gold Kit处理的甲基化的CmpG (在 #5核苷酸位点)DNA.回收的DNA通过PCR来扩增并且直接测序.在 #5位置上甲基化的胞嘧啶仍然保持完整,当未被甲基化的胞嘧啶 (i.e., positions #7, 9, 11, 14 and 15)通过亚硫酸氢盐处理完后全部转化为尿嘧啶.
试剂制备
CT Conversion Reagent的制备 试剂盒中所提供的CT Conversion Reagent是固体混合物并且一定要在首次使用前制备好. 通过添加 900 μl 水, 50 μl 的 M-Dissolving Buffer, 和 300 μl 的 M-Dilution Buffer 到一管的CT Conversion Reagent中. 在室温下溶解并且震荡10分钟或在摇床上摇动10分钟. 如果看到没有溶解的试剂是很正常的, 因为在溶液中的 CT Conversion Reagent 已经达到饱和状态.在使用之前将 CT Conversion Reagent 溶液在室温 (20°C -30°C)下避光保存.每管的 CT Conversion Reagent 是针对10次 DNA 处理设计的.为了得到较好的结果, CT Conversion Reagent 应当在制备后立即使用.如果不立刻使用的
话, CT Conversion Reagent 溶液可以在-20°C存储1星期.而且在使用之前存储的 CT Conversion Reagent 溶液一定要在室温下解冻并且通过震动或颠倒2分钟来混合. CT Conversion Reagent 对光很敏感,所以要尽量减少在光下的暴露.
M-WASH BUFFER的制备 添加24ml (对于200次的D5006应为96ml) 100%的乙醇到M-WASH BUFFER中来制备最终可以使用的M-WASH BUFFER
Protocol：每次制备的DNA 范围在 500 pg 到 2 μg之间. 最佳量为200-500 ng.
在PCR管中添加 130 μl 的 CT Conversion Reagent 到每 20 μl DNA 样品中. 如果 DNA 样品的体积小于 20 μl, 则用水来弥补差量. 通过轻弹试管或移液器操作来混合样品. For Example: 4 μl DNA 样品, 加入16 μl 水, 130 μl CT Conversion Reagent
Note: 对于 DNA 体积 >20 μl, 就要调整 CT Conversion Reagent的制备过程. 对于每增加 10 μl DNA样品体积来说，水的量就要随之减少 100 μl. 例如, 40 μl DNA 样品, 就要添加 700 μl来制备 CT Conversion Reagent. DNA 样品的最大体积为每次转化反应50 μl. 不要调整 M-Dissolving Buffer 或 M-Dilution Buffer的体积.
将样品管放到循环变温器并按以下步骤操作:
1. 98°C 放置 10 分钟
2. 64°C放置2.5 小时
弧面凸轮3. 立刻进行下述操作或者在4°C 下存储(最多20小时).
添加 600 μl 的 M-Binding Buffer 到 Zymo-Spin IC Column 中，并将柱放如试剂盒所提供的Collection Tube中.
装填样品 (从步骤 2)到 Zymo-Spin IC? Column 含有 M-Binding Buffer. 盖上盖将柱颠倒数次来混合样品.
全速 (>10,000 x g)离心 30 秒. 去除流出液.
添加 200 μl 的 M-Wash Buffer 到柱中. 全速离心30 秒.
添加 200 μl 的 M-Desulphonation Buffer 到柱中并且在室温 (20 °C- 30 °C) 下放置 15-20 分钟. 在培养后, 全速离心 30 秒.
添加 200 μl 的 M-Wash Buffer 到柱中. 全速离心30 秒. 再添加 200 μl 的 M-Wash Buffer 并且离心 30 秒.
直接添加 10 μl 的 M-Elution Buffer 到柱基质中. 将柱放置在 1.5 ml 的管中. 全速离心来洗脱 DNA.
光电眼
DNA 可立刻进行分析或储存在低于-20°C 下以备以后使用. 我们建议您对于每次PCR使用 2 - 4 μl洗脱的 DNA.
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