好久好久没给⼤家分享aging的⽂章了，虽然期刊被说的不怎么样，但是也有靠谱的⽂章。今天就跟⼤家分享的是最近发表在aging-us上的⼀篇⽂章，影响因⼦5.515。
Integrative analysis of genomic and epigenetic regulation of endometrial cancer
⾸先让我们通过摘要了解⼀下这篇⽂章的主要内容，⼦宫内膜癌（EC）的特征是DNA拷贝数⾼和DNA甲基化变异。在这⾥，作者试图通过分析整合的基因组和表观遗传分析来全⾯探索这两个因素对EC的发展和进程的影响。作者发现EC中有⾼DNA拷贝数和DNA甲基化异常，具有6308个拷贝数变异基因（CNV-G）和4376个甲基化基因（MET-G）。作者使⽤这些CNV-G和MET-G对样本进⾏分类以进⾏预后分析，并确定了三种分⼦亚型（iC1，iC2，iC3）。此外，亚型表现出不同的肿瘤免疫微环境特征。对其分⼦特征的进⼀步分析揭⽰了三种潜在的预后标志物（KIAA1324，NPR1和IHH）。这三个标记均显⽰出不同的CNV，DNA甲基化和基因表达谱。作者对这三种亚型中的突变进⾏分析后发 现，iC2的突变少于其他亚型。相反，iC2的CNV⽔平明显⾼于其他亚型。总的来说作者对基因组和表观遗传学特征的全⾯分析确定了三个预后标记，并为EC的多层病理学提供了新的见解。
⼀.材料和⽅法
数据收集和预处理
1.1
1.1数据收集和预处理
作者从TCGA中下载了EC中最新的临床随访信息，还有CNV，甲基化，RNA-seq数据和SNP数据并进⾏了预处理。
插销螺母
CNV-G和MET-G
识别CNV-G
巨磁阻传感器1.2
1.2识别
作者对CNV和表达谱（RNA-seq）以及甲基化和表达谱分别计算了每个基因的Spearman相关系数。然后使⽤公式ln（1 + r）/（1-r）将这些系数转换为z值。将p <1e-5的基因定义为CNV-G和MET-G。
CNV-G和MET-G的分⼦亚型
识别CNV-G
1.3
1.3识别
为了进⼀步探索CNV-G和MET-G表达与临床表型之间的关联，基于NCN-G和MET-G基因集的表达谱，使⽤NMF⽅法对样本进⾏聚类。其中NMF是⼀种⽆监督的聚类⽅法，可以⽤于基于基因组学来识别肿瘤的分⼦亚型。
1.4 识别分⼦亚型
作者使⽤R软件包“ iCluster”进⾏多组数据集成聚类分析，并整合CNV-G基因的拷贝数变异（CNV）数据，MET-G基因的甲基化数据（MET）以及 CNV-G和MET-G中基因的表达谱数据（EXP）。考虑到CNV-G和MET-G鉴定的分⼦亚型的数⽬，选择2-4作为聚类K的数⽬。1.5分⼦亚型与肿瘤微环境的关系
作者使⽤TIMER来估计六种免疫细胞的丰度，即：B，CD4 T，CD8 T以及中性细胞，巨噬细胞和树突状细胞，在不同的分⼦亚型中分析了肿瘤微环境中这些细胞的丰度。
为了探究分⼦亚型之间基因表达的差异，作者使⽤DESeq2 ⼯具，使⽤2倍差异和FDR <0.05作为阈值来鉴定分⼦亚型之间差异表达的基因。
1.7分⼦亚型与肿瘤基因组变异之间的关系
为了评估分⼦亚型之间基因组变异的差异，作者从TCGA下载了SNP数据，然后删除了内含⼦和沉默突变。然后，使⽤Fisher精确检验来⽐较两组样本之间突变的差异。使⽤p <0.05的阈值来鉴定突变的基因。
1.8功能富集分析
作者使⽤R包cluster profiler对基因进⾏了GO和KEGG富集分析。
1.9统计分析
使⽤Kaplan-Meier来评估亚型预后的差异，同时进⾏单因素⽣存分析以评估总体⽣存使⽤对数秩检验来检验预后差异，显著性p <0.05。所有分析均在R软件3.4.3版中进⾏。
⼆.结果展⽰
作者确定了总共6308个拷贝数变异基因（CNV-G）和4376个甲基化基因（MET-G）。z值分布的分析表明，CNV-G与相应基因表达谱之间的相关性明显向右移动，⽽MET-G与相应基因表达谱之间的相关性显著向左移动（图1A）。使⽤以95％置信区间进⾏Fisher z转化的进⼀步分析，发现DNA拷贝数的正相关基因 signature（CNV-G，n = 521）和DNA甲基化的负相关基因signature（MET-G， n = 437）。CNV-G和MET-G只有229个基因重叠，这表明CNV-G和MET-G转录失调是相互排斥的（图1B）CNV-G和MET-G基因表现出区域性的基因组偏好，并且⼤多位于19号染⾊体上（图1C，1D）。此外，MET-G主要是蛋⽩质编码基因（图1E），⽽MET位点主要位于CpG岛（图1F）。
图1. CNV-G和MET-G特征谱
2.1基于CNV-G和MET-G基因的分⼦亚型
接下来，作者确定CNV-G和MET-G基因的表达谱是否可以预测预后。聚类分析显⽰CNV-G和MET-G的最佳聚类数均为4（图2A和2B）。Kaplan-Meier（KM）图显⽰了总⽣存期（OS），各组之间的预后结果存在显著差异（图2C和2D）。此外，CNV-G和MET-G的四个⼦类之间存在显著重叠（图2E，2F）。
屋面天窗
图2. 基于CNV-G和MET-G基因的分⼦亚型
2.2将CNV、MET和EXP数据集集成起来进⾏聚类分析
为了优化聚类，作者在K = 2和K = 3中重复了20次聚类。结果表明，rank = 2（3类）⽐rank = 3（4类）
更稳定。最终iCluster被聚合为三个⼦类：iC1（95个样本），iC2（128个样本）和iC3（198个样本）。根据iCluster的CNV⽔平分布，发现iC2中的CNV⾼于iC1和iC3（图减速路拱
3A），⽽甲基化⽔平在各组之间是相当的（图3B）。KM⽣存分析表明，三组之间的OS有显著差异（图3C）。三组之间的进⼀步⽐较显⽰出iC1，iC3和iC2亚型之间的预后显著不同（图3D，3E）。但是，iC1和iC3亚型之间的预后没有显著差异（图3F）。
图3.聚类分析
对苯树脂
2.3 DNA拷贝数异常与甲基化异常⼀致
为了研究CNV与MET异常之间的关系，作者将CNV的β值> 0.3定义为CNV扩增。β值<-0.3作为缺失; MET的β值> 0.8表⽰为MetHyper（超甲基化）; β值<0.2表⽰MetHypo（去甲基化）。作者计算了每个样本的CNV扩增，缺失，MetHyper和MetHypo的数量，发现扩增，缺失和MetHypo之间具有显著相关性（图4A，4C），与MetHyper⽆关（图4B）。此外，尽管两者均与MetHypo显著相关（图4E），但Loss和MetHyper之间没有显著相关性（图4D）。MetHyper和MetHypo显⽰出很强的负相关性（图4F）。
图4
2.4分⼦亚型中肿瘤微环境的特征
作者根据多组数据将EC分为三个亚组，然后⽐较iC亚型在阶段，等级，年龄和BMI⽅⾯的临床特征差异。结果显⽰，在具有不同临床特征的样本中，iC亚型的分布存在显著差异（表1）。
表1. EC亚型之间的临床特征⽐较
接下来作者使⽤TIMER来⽐较这三种亚型的免疫评分，发现与其他亚型相⽐，iC2亚型中有六种免疫细胞评分较低，并且预后最差（图
5A，5B），这表明 iC2亚型可能代表⼀种免疫抑制状态。对⽐分析进⼀步显⽰，与其他亚型相⽐，iC2亚型的巨噬细胞调节和淋巴细胞浸润评分显著降低，⽽iC2中与伤⼝愈合和炎症（IFN-γ反应）相关的评分显著⾼于其他亚型（图5C） 。这进⼀步表明免疫状态可能会影响EC的预后。
图5
声阻抗率
2.5亚型的分⼦特征
根据iCluster的结果，作者⽐较了iC1 / iC3和iC2之间的差异表达基因（DEG）。在三组中共识别了207个DEG。GO分析表明这些基因显著富集于与免疫有关的terms。iC2中207个DEG的CNV频率显著⾼于iC1和iC3，这表明CNV影响了EC的预后（图6A）。但是在分⼦亚型之间的甲基化⽔平没有差异（图6B）。表达⽔平、甲基化和CNV之间的相关性显⽰去甲基化样本中DEGs的⾼表达（图6C），但是在CNV中没有观察到。这表明甲基化对DEGs表达的影响强于CNV对DEGs表达的影响。
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