收稿日期:2003208206
作者简介：李德茂，男，硕士研究生，主要从事手性化合物的生物合成.
通讯联系人：刘四新，博士，副教授，主要研究方向为应用微生物技术,Tel :(0898)23300536,E 2mail :liusixin @21cn.
李德茂, 李从发, 刘四新, 陈利梅
(华南热带农业大学工学院，海南儋州571737)
摘要：考察了环糊精种类、环糊精浓度、缓冲溶液p H 、分离电压、温度等因素对32苯基乳酸手性分离的影响，并对分 离条件进行了优化。结果表明，采用区带毛细管电泳技术，以0103mol/L 的羟丙基2β2环糊精为手性选择剂,011
mol/L 的磷酸缓冲溶液(p H 515)为电泳缓冲溶液,26kV 的分离电压，在25℃下可使32苯基乳酸对映体达到基线分离，分离度为1151。
关键词：毛细管电泳;32苯基乳酸；羟丙基2β2环糊精；手性分离
中图分类号:O 658 文献标识码:A 文章编号:100028713(2004)0320281203
Chi r al S ep a r a ti o n of 32Phe nyllactic Aci d by
消息队列实现Capilla ry Elect r op hor esis
LI Demao ,LI Congfa ,LIU Sixin ,CHEN Limei
(College of Technology a nd Engi neeri ng ,South Chi na University of Tropical Agricult ure ,Da nzhou 571737,Chi na )
智能训练Abs t ract :Various factors affecting the chiral res olution of 32p henyllactic acid by capillary zone electrop horesis s uch as the type of cyclodextrin ,concentration of the chiral selector ,buffer p H ,
voltage ,and temperature were studied and optimized.Using 30mmol/L hydroxypropyl 2β2cyclodex 2
trin as the chiral selector ,and 0.1mol/L p hosp hate s olution (p H 5.5)as the running buffer ,the baseline separation of 32p henyllactic acid enantiomers was achieved with a res olution factor of 1.51.The separation voltage was 26kV and the temperature was 25℃.
电梯运行检测平台
Key w or ds :capillary electrop horesis ;32p henyllactic acid ;hydroxypropyl 2β2cyclodextrin ;chiral
separation
32苯基乳酸，即22羟基232苯基丙酸，是一种重要的化学合成前体，广泛应用于医药、化工、生物合成等领域。它的第2个碳原子为手性碳原子，故有两种对映体(见图1)。这两种构型的化合物对生物体的作用及其在医药、化工方面的应用不同:D 2苯基乳酸(即R 2苯基乳酸)可用于合成降血糖药Englita 2zone [1]、驱肠虫药(如PF 1022A )[2];L 2苯基乳酸(即S 2苯基乳酸)可用于合成高血压蛋白酶原肾素抑制剂[3]、非蛋白氨基酸Statine [4]、抗艾滋病病毒(HI V )剂[5]等药品。Y amam oto 等[6]的研究还发现,R 232苯基乳酸对人体内类固醇的水平有一定的调节作用。32苯基乳酸的两种构型在医药、化工中应用方向的不同使得对其进行拆分具有重要意义。 近几年毛细管电泳在手性化合物的拆分中获得了广泛应用。Armstrong 等[7]以抗生素ristocetin A 作手性选择剂，用毛细管电泳对32苯基乳酸进行拆分，但其分离度不高，仅为017。Fanali 等[8]用抗生素M D L 63246(Hepta 2T yr )为手性选择剂，拆分了32
苯
图1 32苯基乳酸的对映异构体结构Fig.1 Molec ula r s t r uct ures of t he e na nti ome rs
of 32p he nyllactic aci d
a.R 2(+)232phenyllactic acid ;
b.S 2(-)232phenyllactic acid.
基乳酸。Nardi 等[9]用6A 2甲氨基26A 2去氧2β2环糊
精(62MeNH 2β2CD )和6A ,6D 2二甲氨基26A ,6D 2去氧2
β2环糊精(62di 2MeNH 2β2CD )(A 表示第1个葡萄糖单元,D 表示第4个葡萄糖单元)涂敷毛细管壁，以毛细管区带电泳拆分得到R 和S 型32苯基乳酸。
Schmid 等[10]
采用配体交换毛细管电泳法，以N 2(22羟辛基)2L 242羟辅氨酸2酮拆分了32苯基乳酸。不过，以上拆分方法存在分离度低、操作繁琐或试剂难
以制备等缺点。我们以羟丙基2β2环糊精为手性选
2004年5月May 2004
谱
Chinese J ournal of Chromatography
Vol.22No.3
281～283
金融查询择剂，用毛细管电泳对32苯基乳酸的拆分进行了研
究。本研究克服了上述缺点，操作简单，所需样品、溶剂和手性选择剂均较少，成本低，不需制作毛细管涂层，获得了满意的分离效果。
1 实验部分
1.1 仪器与材料
旋转密封件
带有紫外检测器的P/ACE System MDQ毛细管电泳仪(美国Beckman公司)，未涂层石英毛细管(60cm/75cm×50μm i1d1)(河北永年锐沣谱器件有限公司),Mettler Toledo3202S p H计(梅特勒2托利多仪器上海有限公司),SZ293自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。
32苯基乳酸(Sigma公司),β2环糊精(β2CD)、γ2环糊精(γ2CD)、二甲基2β2环糊精(DM2β2CD) (Beckman公司)，羟丙基2β2环糊精(HP2β2CD)(西宝生物科技有限公司)，磺酰化2β2环糊精(SO32β2 CD)(Aldrich公司)，磷酸二氢钠(分析纯，上海新华化工厂)，氢氧化钠(分析纯，汕头市光华化学厂)，试验用水为重蒸水。
磷酸缓冲溶液：精密称取一定量的NaH2PO4，用重蒸水定容，用011mol/L NaOH或011mol/L H3PO4调至所需p H，将环糊精溶于其中，经0145μm 的滤膜过滤。样品用重蒸水配制成质量浓度为011 g/L的溶液，冷藏备用。
1.2 电泳条件
每天运行前用011mol/L NaOH、水、运行缓冲溶液分别洗柱10,3,2min，每两次运行之间用011 mol/L NaOH、水、运行缓冲溶液分别洗柱5,3,2 min。正极进样，负极检测。进样压力31445kPa，进样时间4s；分离电压26kV；紫外检测波长214nm；分离温度25℃。
2 结果与讨论
2.1 手性选择剂的种类对分离的影响
用于毛细管电泳的手性选择剂主要有糖类(环糊精、多糖)、两性物质(氨基酸、蛋白)、药物(大环抗生素)、合成化合物(手性冠醚、手性杯芳烃)、表面活性剂(天然物、合成试剂)等，而当前以环糊精及其衍生物最为常用[11]。本研究选用电中性的β2CD、γ2 CD、DM2β2CD、HP2β2CD和带负电的SO32β2CD等5种环糊精进行试验，结果表明，只有HP2β2CD可拆分32苯基乳酸，这可能是HP2β2CD的特殊结构(见图2)所决定的。
HP2β2CD中羟丙基上的羟基相对于其他羟基受到更少的约束力，并且这一延长的羟基恰好能与32苯基乳酸的手性碳很好地结合[12]，故选用HP2β2CD作手性选择剂。
图2 HP2β2CD结构图
Fig.2 The s t r uct ure of HP2β2CD
R=CH2CH(OH)CH3or H.
2.2 缓冲溶液的p H对分离的影响
我们选择了p H值为410～1010进行研究。结果表明，在p H为410和415时,1h之内未见拆分，这可能与低p H时因电渗流减小而使总迁移率下降、迁移时间过长有关；在p H510～1010时，随着p H的增加，迁移时间变短，分离度降低(见图3)，这可能是因为电渗流随着p H值的升高而增加，引起迁移时间缩短，而分离度降低可能与羧基的解离增加及迁移时间缩短有关。Fanali等[13]认为，羧基解离很可能会影响羧基与环糊精边缘取代基之间立体选择性的氢键的形成。因在p
H515时两个对映异构体即达到基线分离(R s=1151)，而且迁移时间相对较短，故选择p H515作为缓冲溶液的p H值。
图3 缓冲溶液的p H对分离的影响
Fig.3 I nfl ue nce of p H of buff e r on res ol uti on Buffer,0103mol/L HP2β2CD,011mol/L NaH2PO4at different p Hs;injection,31445kPa×4s;separation voltage,26kV;capil2 lary dimension,60c
m/75cm×50μm i1d1;capillary temperature, 25℃.
2.3 环糊精浓度对拆分的影响
在p H515的缓冲溶液中，考察了0101～011 mol/L的HP2β2CD对拆分的影响。结果发现，随着环糊精浓度的增大，其分离度增加，但迁移时间变长(见图4)。这是因为随着HP2β2CD浓度的增加，手
・
2
8
2
・谱第22卷
性选择剂与32苯基乳酸的结合位点增加，因而分离
度增大；迁移时间的增加可能和HP 2β2CD 与32苯基
乳酸的结合及缓冲溶液粘度的增加有关。综合考虑迁移时间、分离度以及环糊精的用量，选择缓冲溶液
中HP 2β2CD 的浓度为0103mol/L
。
图4 HP 2β2CD 浓度对分离的影响
Fig.4 I nfl ue nce of conce nt ra ti on of
HP 2β2CD on res ol uti on
Buffer ,different concentrations of HP 2β2CD ,0.1mol/L
NaH 2PO 4at p H 515.For other experimental conditions ,see Fig.3.
2.4 缓冲溶液浓度对拆分的影响
当缓冲溶液浓度由0102mol/L 上升到0112mol/L 时,
分离度逐渐升高，而且迁移时间增加(见图5)；当达到0114mol/L 时，迁移时间继续增加，但分离度已降低，这可能是因为离子强度的增加降低了双电层的厚度而使电渗流降低，从而使分离度升高，而离子强度的增加使电流由0102mol/L 时的16μA 升高到0116mol/L 时的109μA ，电流的升高会使焦耳热增加，又会影响分离度。综合考虑分离度和迁移时间，选择缓冲溶液的浓度为011mol/L 。
图5 缓冲溶液浓度对分离的影响
Fig.5 I nfl ue nce of conce nt ra ti on of buff e r on res ol uti on
Buffer ,0103mol/L HP 2β2CD ,different concentrations of
NaH 2PO 4at p H 5.5.For other experimental conditions ,see Fig.3.
2.5 分离温度、分离电压对拆分的影响
研究发现，随着温度的降低，分离度会升高。这可能是因为随着温度的降低，涡流或振动能降低，从
而增加了32苯基乳酸对映体与HP 2β2CD 的内部和边缘的结合力，使得HP
2β2CD 的对映体选择性增强[14]。电压为16～30kV 时，随着电压的升高，其分
离度也升高,26kV 时达到最大，然后分离度随着电
压的升高而降低，分离效果变差。这可能是因为过高的电压导致焦耳热升高而影响分离，使得分离度降低。综合考虑分离度和迁移时间，选择分离温度为25℃，分离电压为26kV 。2.6 结语
以HP 2β2CD 为手性选择剂分离了32苯基乳酸
的两个对映体，在优化的分离条件下，分离度为1151。拆分方法简单，电泳图见图6。
图6 32苯基乳酸的手性分离电泳图Fig.6 The elect r op he r ogra m f or t he chi ral
s ep a ra ti on of 32p he nyllactic aci d
Chiral selector ,0103mol/L HP 2β2CD ;buffer ,011mol/L
NaH 2PO 4at p H 515.For other experimental conditions ,see Fig.3.
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382・ 第3期李德茂等:32苯基乳酸的手性毛细管电泳拆分
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