DNA定点突变实验方法原理及步骤详解

DNA定点突变实验⽅法原理及步骤详解

实验⽅法原理定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等⽅法向⽬的DNA⽚段（可以是基因组，也可以是质粒）中引⼊所需变化（通常是表征有利⽅向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。

单点突变的原理是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提得到质粒。设计⼀对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退⽕后⽤PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，⼀圈后回到引物5’端终⽌，再经过反复加热褪⽕延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退⽕后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规⼤肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感⽽被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在⼏乎各种质粒中都会出现，⽽且不⽌⼀次），⽽体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化⽽不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。

多点突变的原理是准备多个带突变的引物（同⽅向，对同⼀单链模版），退⽕后全部突变引物（不超过5个）都结合在同⼀环状单链模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下⼀个引物就停⽌，各⽚断经连接成环，和单链模版组成杂和环，Dpn I消化双链模版，也消化杂和环中的模版，只留下新合成的带多个突变的单链环（mutant ssDNA），得以转化E.coli，形成双链质粒。资料表明，引⼊3个定点突变的效率为60%，

5个定点突变的效率为30%。得到的其他质粒是带有较少定点突变的质粒，以引⼊3个定点突变为例，就是有40% 左右的转化质粒是带有1-2个不同定点突变的质粒（因为存在1-2个引物结合模版延伸形成单链环的可能）。

实验

材料

DNA

萨纳克

试

剂、

试剂

盒

pyrobest DNA聚合酶DpnI去离⼦⽔BSA⼤肠杆菌DH5a菌株

仪

器、

耗材

PCR仪离⼼管移液头头盒⽔浴锅灭菌锅培养箱

⼀、引物设计

每条引物都要携带有所需的突变位点，引物⼀般长25~45 bp，设计的突变位点需位于引物中部。

⼆、反应

1. 使⽤⾼保真的pyrobest DNA聚合酶，循环次数少，⼀般为12个循环。

2. 反应体系：

（1）10x pyrobest Buffer：5 ul

开关柜除湿

（2）dNTP Mixture(10 mM) ：1 ul

（3）模板DNA(5~50 ng) ：1ul

卷帘门电机接线图

（4）primer 1 (125 ng) ：1 ul

（5）primer 2 (125 ng) ：1 ul

防爆节能灯（6）pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5 U/ul)：0.25 ul

（7）加⽆菌蒸馏⽔⾄50ul.

实验步骤（7）加⽆菌蒸馏⽔⾄50ul.

三、产物沉淀纯化

1. 加1/10 体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上（或-20℃冰箱）5min，离⼼弃上清。

2. 70~75%⼄醇洗盐两次，烘⼲后溶于⽆菌⽔中（此步可省略，直接⽤ DpnI酶切）。

四、DpnI酶切

1. 酶切体系

（1）Buffer ：2 ul

（2）BSA（100╳）：0.2 ul弹簧包

（3）DNA ：x ul

（4）DpnI：0.5 ul

（5）加⽆菌去离⼦⽔⾄ 20 ul。

2. 30℃酶切 1~4 h。

3. 65℃⽔浴15min 终⽌反应。

五、转化

将酶切产物转化⼤肠杆菌DH5a菌株，利⽤抗⽣素筛选突变⼦。

六、测序验证

注意事项1. 引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能⽤平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到⼏个K，所以要⽤那些GC buffer或扩增长⽚段的buffer，另外，要⽤保真性能较好的PFU 酶来扩增，防⽌引进新的突变。

涂改液

2. Quick change试剂盒分为⼏种不同的类型，QuikChange®、Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒、QuikChange®、 XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（>8kb）从原理上是⼀样的，只是PCR 的酶和BUFFER不⼀样，后⾯⽤了⽐较适合长⽚段扩增的酶和BUFFER罢了，没什么特别的东西。

3. DpnI处理的时间最好长⼀点，最少⼀个⼩时吧，最好能有两三个⼩时，因为如果模板处理得不⼲净，哪怕只有那么⼀点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。

4. 实验板长出来的菌有两种可能，⼀种是质粒DPNI没处理⼲净长出来的（模板），⼀种是PCR产物转化出来的（突变体），不过这两种菌长得⼀模⼀样，即使提出质粒来也是⼀样（酶切和PCR都⽆法区分），除了测序，是分不出来的。

5. 做PCR时也最好做⼀个负对照（不加引物），实验管由于PCR时有引物，所以在DNPI处理前⾥⾯既含有模板⼜含有PCR产物，⽽对照管由于PCR时没放引物，所以在DPNI处理前⾥⾯只有模板。如果两者都拿去DNPI处理，就能够证明模板已经被去除⼲净。若实验顺利的话应该是：正对照长菌负对照不长菌。如果出现正负对照都长菌，那么就是DpnI没处理好，如果正负对照都不长菌，那么有两种可能，⼀种是PCR阴性，也就是说PCR出问题了，另外⼀个可能就是转化出问题了。要搞清楚是哪个问题，跑胶说明不了问题，那就做个转化的对照，拿试剂盒的对照实验去试感受态，马上就能知道转化有没问题。

本文发布于:2024-09-21 19:37:33，感谢您对本站的认可！

本文链接：https://www.17tex.com/tex/1/239124.html

上一篇：散发性SDH缺陷型胃肠道间质瘤26例临床及分子病理学特征

下一篇：探析报业集团业财税一体化体系构建

标签：突变质粒引物延伸模版模板

留言与评论（共有 0 条评论）