简介（INTRODUCTION）
定点突变（site-directed mutagenesis）是指通过聚合酶链式反应
（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR）2. 一步法（全质粒PCR） ►搭桥法（重叠PCR）定点突变
搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR，其中前两次PCR可同时完成，原理如图一所示：两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。 引出线
PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增
PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增
轴向变量柱塞泵实验步骤（PROCEDURE）
1.两对引物的Tm值都应相当。两端PCR引物参照普通引物设计并无特殊要求。所需引入突变包含在中间引物互补区域内 （需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导
致引物与模板无法结合。
106581542.对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，也可是部分互补。但两引物间互补部分的Tm值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。
5’-NNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’
完全互补
5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNN-5’
部分互补
5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
3’-NNNNNNNNNNNNNNNT-5’
部分互补
一对中间位置的点突变引物设计
拉碗
3.PCR：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增。两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。（注意前两次不能使用taq聚合酶，因为taq在产物3’ 端多加一个A，导致后续的PCR3出现移码突变）
4.克隆：回收PCR3产物，酶切，连接，转化。
全方位接触►一步法定点突变
一步法是以质粒为模板，考虑扩增效率需将正向引物和反向引物分开扩增，避免二聚体的产生。原理如图
实验步骤（PROCEDURE）
5.引物设计：设计一对含有目标突变的引物，除所需要引入的突变位点外，其余序列与质
粒模板完全匹配。不同于搭桥法的一对中间引物，全质粒PCR法的一对引物最好不是完全配对，因为这对引物是放在一个PCR反应中，完全配对极易形成引物二聚体，而不是与模板质粒结合。这就要求两条引物间配对区域的Tm值要小。
6.PCR。PCR1：质粒+正向引物扩增，PCR2：质粒+反向引物扩增。两次PCR均按照常规PCR程序进行，不同的是只反应12个而不是30个循环。PCR3：PCR1和PCR2反应完成后，将二者体系混合成一个体系并补加适量的高保真聚合酶（如Pfu 或 Pfu-X1），然后按照常规PCR程序继续反应16个循环。
▲关键步骤：
♫不能用taq酶，一是taq酶无3’-5’外切酶活性导致保真性差，全质粒PCR片段长，易出现非目标突变。二是因为taq酶具有5’-3’外切酶活性这就导致当PCR以质粒为模板复制一圈回到最初引物位置时，原有引物会被外切导致引入的突变又变回野生型质粒的序列。
♫为防止非目标突变，PCR循环数不要太多（建议不超过25个cycle）
♫在质粒能正常扩增的前提下，应尽量减少质粒模板使用量以免模板质粒消化不完全背景
增加。（酶切和PCR都无法区分）
7.PCR产物的甲基化酶处理
8.待突变的质粒通常来源于DH5α等dam+大肠杆菌，在这些dam+细菌中质粒会被甲基化修饰，而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。这样用特异性识别甲基化位点的酶DpnI处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来（DpnI1111s 酶只消化甲基化的DNA）。随后把DpnI处理过的产物转化感受态细菌后，突变质粒中的两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。
9.向PCR产物中加入1 μL DpnI 酶和4 μL的10× NEB cutsmart buffer消化模板质粒置于37°C反应1 h，取出5 μL跑胶检测，剩余的取部分做细菌转化，涂板。筛选转化子，测序。
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