第41卷第4期中国高原医学与生物学杂志Vol.41No.4 2020 年CHINESE HIGH ALTITUDE MEDICINE AND BIOLOGY 2020
青海地区胃腺癌患者T G F p i基因的甲基化状态& 赵琳，王学红'安琪，李春霞，王昀，李苏华，马雪芹，郜茜，绽永华，杨生森，李源化
(青海大学附属医院，青海西宁810001)
摘要目的通过检测青海地区胃腺癌患者癌组织及癌旁组织中的T G F J3I基因启动子区域的 曱基化状态，探讨TGFpI基因甲基化与青海地区胃腺癌发生的相关程度。方法收集青海大学附属
医院经胃镜及病理首次确诊的28例胃腺癌住院患者为研究对象，采用亚硫酸氢盐测序（BSP)检测各 样本TGFpI基因甲基化状态，比较癌组织和癌旁组织的甲基化状态差异。结果胃腺癌组织甲基化 克隆个数为478个，其甲基化率为11.42%；癌旁组织甲基化克隆个数为293个，其甲基化率为6.98%;
胃腺癌组织甲基化程度高于与其相匹配的癌旁组织，差异具有统计学意义（/^O.001)。结论青海
地区患者胃腺癌组织甲基化状态显著高于与其相匹配的癌旁组织甲基化状态，说明青海地区胃腺癌 高发可能与TGFpI基因启动子甲基化程度过高有关。
关键词：TGFp丨基因；曱基化；胃腺癌
中图分类号：R394 文献标识码：A
D O I：10. 13452/jki. jqmc.2020. 04. 002
Methylation of TGFpi gene of patients with gastric
adenocarcinoma in Qinghai area '
Z H A O L i n,W A N G X u e h o n g*，A N Q i，Ll C h u n x i a，W A N G Y u n，LI S u h u a,
M A X u e q i n，G A O Q i a n，Z H A N Y o n g h u a，Y A N G S h e n g s e n，IJ Y u a n h u a
(Affiliated Hospital of Qinghai University ,Xining 810001 ,C h i n a)
Abstract Objective T o investigate the methylation of T G F p i ge n e in the promoter region in cancer tissues a n d adjacent tissues of patients with gastric a d e n o c a r c i n o m a in Qinghai area. Methods 28 confirmed cases with gastric a d e m o c a r c i n o m a diagnosed b y gastroscopy a n d pathology for the first time in the Affiliated Hospital of Qinghai University w e r e selected as the research objects. T h e methylation of T G F p I g en e w a s detected by Bisulfite S e que n-
c i n g(B S P)t o c o m p a r e the differences of methylation be t w e e n cancer tissues a n
d adjacent tissues. Results T her
e we r e 478methylated clones in the tissues o
f gastric a d e n o c a r c i n o m a with a n average methylation rate of 11.42%；there w er e 293 methylated clones in adjacent tissues with an average methylation rate of 6. 98%；the degree of m e t hylation in the tissues of gastric a d e n o c a r c i n o m a w a s significantly higher than that of its m a t c h e d adjacent tissues. T h e difference w a s statistically important( P<0. 001 ). Conclusion T h e degree of methylation in gastric a d e n o c a r c i n o m a w a s significantly higher than, that of its m a t c h e d adjacent tissues,w h i c h indicated that the high incidence of gastric a d e n o c a r c i n o m a in Qinghai m a y b e related to the high degree of methylation of T GF^p i
g e n e promoter.
Keywords ：TGF(3I g e n e；methylation ；gastric ad en oc a r c i n o m a
※：青海省自然科学基金（2017-ZJ-913); * ：通信作者，教授，E-mail:Lindawang0710@hotroail. com
平面音响
赵琳（1993〜），女，土族，青海籍，硕士研究生
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胃腺癌（Gastric adenocarcinoma)的发病机制尚 不明确，目前认为是由遗传因素、生物因素和环境因 素共同作用的结果。遗传学是肿瘤的研究基础，随 着对肿瘤机制研究的不断深人，人们认识到肿瘤基 因表达模式的改变不仅包含遗传学改变而且包含了 更多的表观遗传学改变，表观遗传学改变在肿瘤的 启动和进展中发挥着比遗传学更为重要的作用，因此表观遗传学的提出为肿瘤研究者带来了新的思 路。表观遗传是没有DNA序列变化的可随细胞分 裂而遗传的基因组修饰或基因表达调控，包括DNA 甲基化、组蛋白修饰等，这种基因序列不变而基因表 达改变的作用机制在多细胞生物的发育中至关重 要"，并能确保基因表达发生在正确的“时间”和 “地点” 2]。DNA甲基化已经成为表观遗传学重要 研究内容和国内外研究的热点。大量研究揭示了转 化生长因子 P 诱导基因（transforming grow th factoi'p induced gene，TGFp I )具有为抑癌因子或肿瘤启动 因子的双重角作用[3]。青海是我国胃癌高发区:4i，其高发病率的确切机制尚不明确。本研究应 用MethPrimer在线平台预测TGF(3I所富含CpG岛(共计15个CpG位点）的序列；利用亚硫酸氢盐测 序（bisulfite sequencing PCR，BSP)法，对青海地区 28例胃腺癌患者TGFp I基因启动子区的甲基化状 态进行检测，初步探讨TGFp I基因甲基化与青海 地区胃腺癌发生的相关程度。 1.对象及方法
1.1一般资料
选择2019年3月至11月期间在青海大学附属 医院住院经胃镜及病理首次确诊的28例胃腺癌病 例为研究对象，收集患者的临床病理资料，在行胃镜 检查时取胃腺癌组织、配对癌旁组织样本各28个; 男性18例，女性10例。
1.2纳入标准
61850 mms①由胃镜确诊的胃癌患者;②在青海生活逾20 年者;③未行放化疗;④未患有影响本研究结果的其 他疾患;⑤所有研究对象均签署知情同意书，且通过 青海大学附属医院伦理委员会批准（批准文号：X H K-2017-S K J T-001)。
1.3研究步骤
①胃癌组织及癌旁组织DNA提取：按Ezup柱 式组织基因组DNA抽屉试剂盒（B518251，上海生 工）说明书步骤进行。②DNA亚硫酸氢钠修饰：将 各标本的DNA(20pL)依照修饰试剂盒说明书进行。③引物设计、PCR扩增：应用MethPrimer在线 平台预测TGFp I基因（序列总长度:2040bp) ;CPG 岛预测结果：共发现1个CpG岛（长度11lb P)，位 于18乃〜1985 bP。其中包含有15个CpG位点。引物由上海生工生物公司设计，PCR扩增引物序列：上游 弓|物 TA A G G G TTG G G A A A A TTG A G TA；下
游弓|物 (XCRAACCAAATTAAATAAACTAC。PCR 反应条件：在95丈下预变性3〜5 min；在94 t下变性30 sec；在55 t~60 T；内退火25 ~ 30 sec；在72 t下延伸30 ~50 sec，将2〜4环节做35个循环；在72尤下修复延 伸5~8min。④电泳检测条带：取PCR产物5 (xL 行1%琼脂糖凝胶电泳（150V,100mA，10~20min)观察。⑤连接反应体系组成：1pLlOLigation Buffer，】（j l L50%PEG，50 ng pUCmT Vector，0. 2 pmol-PCR Product，x |j l LH20,2.5 U T4 DNA Ligase，10 (xL Final Volume〔按试剂盒说明书转化步骤制备感受态 细胞（SK9307)〕。⑥蓝白斑筛选：将IPTG/X-gal 平板上的白菌落在含氨苄青霉素的液体培养基过 夜(371)。最后采用3%糖凝胶电泳检测法，对目 的片段TA克隆的菌落行PCR鉴定。⑦测序。
1.4统计学方法
所有数据使用SPSS 19. 0统计软件分析。两样 本率的比较、分析采用X2检验法或Fishei■确切概率 法，视P<0_ 05为有统计学意义。
2.结果
2.1胃腺癌患者癌及癌旁组织中TGFp I基因启 动子区域甲基化状态
检测28例胃腺癌及其配对癌旁组织T G F p I基 因启动子区域的甲基化状态，总克隆8385个C p G 位点
（胃腺癌组织:4丨85；癌旁组织:4200)，其中甲 基化阳性克隆771个（胃腺癌组织:478个；癌旁组 织293个）。癌组织中平均甲基化率为11.42%；配 对癌旁组织中平均甲基化率为6.98%，差异具有统 计学意义(p<0.001)(表1)。
2.2 TGFp I基因启动子区域甲基化与临床病理特 征的关系
整理28例胃腺癌患者的临床病理特征资料，进 一步分析癌组织中TGFp I基因启动子甲基化结果 与临床病理特征之间的关系。胃腺癌患者癌组织中 的TGFp I基因启动子甲基化率在不同性别、年龄、肿瘤分化程度、浸润深度、TNM分期患者间未发现 统计学差异（〇〇.〇5)(表2)。
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表1 Table 1
胃腺癌患者癌及癌旁组织中的TGFp I甲基化率
Methylation rate of TG Fpi in the tissues of gastric adenocarcinoma and its adjacent tissues
组别总克隆个数甲基化克隆个数甲基化率（％)X2P 癌组织418547811.42
49. 617<0. 001
癌旁组织4200293 6.98
表2胃腺癌组织T G F p i甲基化状态与临床病理特征的关系
Table 2 Relationship between the status of methylation of TG Fpi and clinicopathological characteristics
in gastric adenocarcinoma
项目例数甲基化例数甲基化率（％)P
性别男181794.44
0.284女10880.00
年龄（岁）彡60151386.67
1.000 >6013129
草甘膦母液2.30
分化程度
高分化171588.24
0. 268中低分化1111100
浸润深度T1T211100
管式反应器
1.000 T3T4272488.89
远端转移有600
1.000无22314.29
T N M分期
1、1114214.29
1.000 III、IV1417. 14
注：胃腺癌患者临床病理分期标准参照美国癌症联合委员会（A J C C)和国际抗癌联盟（U I C C)联合制订的恶性肿瘤T M N分期标准。
3.讨论
Feinberg和Vogelstein发现[5，在肿瘤中同时存 在两个互相矛盾的表观遗传现象，即全基因组低甲 基化和局部高甲基化。有研究认为[6][7]，全基因组 的低甲基化可以导致raS、C-myc等原癌基因激活，而DNA启动子区CpG的高甲基化可以导致pl6、APC等抑癌基因失活，两者协同作用可致肿瘤发生。TGF(3I基因最早是从由TGF-(31刺激的A549 肺腺癌细胞中克隆得到的基因,TGF(3I基因存在广 泛，它可由多种类型的细胞产生，在人膀胱平滑肌和 成纤维细胞中表达[8]，也可以在肾近端小管细胞中 表达W。作为细胞外基质分子之一，最先被关注的 是其调节细胞黏附功能和迁移功能。随着研究的深 人，发现TGFp I基因在多种肿瘤中均有表达，但有 关其作用的报道不一致。有研究认为[1°]，在肾癌、胰腺癌及结肠癌中TGFp I基因呈现高表达，并可 诱导、增强肿瘤发生侵袭转移的能力；与其相反的 是[11][12]，在肺癌、乳腺癌细胞中，TGFp I表达水平 明显下降或表达缺失。DNA甲基化，作为最热门的 表观遗传学修饰方式之一，它在细胞生物学中有着十分重要的作用。DNA甲基化是在DNA甲基转移 酶（DNMTs)的作用下，于胞嘧啶碱(5-甲基胞嘧啶）的碳-5位置加人一个甲基[13]。研究证明基因的表 达结果会因为DNA甲基化而导致基因沉默致使该 基因的表达降低，抑或是DNA甲基化反而导致基因 过度表达[3]，而这些过度表达的癌基因可促进肿瘤 的发生[14]。因此，频繁、连锁性的DNA髙甲基化和 DNA低甲基化与肿瘤的产生和肿瘤的进一步发展 可能有着密不可分的关系。
Han[151等在对胃癌、肝癌等消化系统肿瘤的研 究中用E L I S A法测定胃癌患者血清T G F p1水平, 得到了患者血清TGFp I水平明显升高的结论，考 虑异常过量表达的TGFp I基因可能来源于肿瘤本 身，
且T G F p I基因过表达导致自发性肿瘤发生率增加，提示在胃癌中T G F p I基因可能扮演的是“癌 基因”角。同时Kiic h i S u g i m〇t〇[16]等收集了原发 性胃癌（primarygastriccancers，P G C)及残胃癌（rem-nantgastriccancers，R G C)的病例样本，对全基因组D N A启动子进行甲基化分析证实了在基因普遍高 甲基化组中P G C的贡献显著，表明P G C的启动子
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甲基化状态髙于RGC(P= 0.004)，这也进一步阐明
了PGC与甲基化的关系。我们的研究应用BSP法，
检测28例胃腺癌患者癌组织及其配对癌旁组织中 TGF(3I基因启动子区域的甲基化状态，并与相关临
床病理资料进行相关性分析。本研究结果显示，胃
腺癌患者癌组织中TGFp I基因启动子甲基化程度
明显高于癌旁组织（P<〇.〇〇1)。因此我们的研究也
得出了与Kiichi Sugimoto —致的研究结果，提7K TGFpI基因在胃癌中可能作为“癌基因”存在，高甲基
化会上调其表达，从而参与胃癌的发生。Shah[1°]、YangkiSeok[1I]等的研究结果认为DNA高甲基化与
肿瘤的淋巴转移、局部侵袭呈正相关；但我们的研究
发现，胃腺癌患者癌组织中TGFpI基因启动子甲基化
率在不同性别、年龄、肿瘤分化程度、浸润深度、T N M
分期患者间不存在统计学差异(P>〇.〇5)。本研究样
本数有限，需进一步行大样本研究。
TGFp I基因在胃腺癌中可能为癌基因，其启动
子区高甲基化状态可能与青海胃癌高发相关。
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