【摘要】 目的 探讨肝癌细胞的CDH1基因启动子甲基化状态，观察应用5 氮 2′ 脱氧胞苷(5 aza CdR)后细胞的生物学特性的变化。方法 应用MSP法检测肝癌细胞用药前后其CDH1基因启动子甲基化状态，并应用Western blot方法检测E61850 mms
cad蛋白表达情况，同时检测用药前后细胞的黏附、迁移、侵袭能力。将经药物处理和未处理过的肝癌细胞分别种植到小鼠体内，观察肿瘤细胞的生长体积的大小及侵袭、转移情况，并检测其外周血中的E cad 、E 选择素、AFP含量。结果 在肝癌细胞中E cad蛋白表达下调与CDH1基因启动子甲基化状态有关，经过5 aza CdR处理过的细胞侵袭性和迁移性降低，黏附性升高。体内实验发现处理过的肿瘤细胞发生局部侵袭和远处转移能力减弱，肿瘤体积变小，但外周血E cad 、E 选择素、AFP含量降低。结论 肝癌7721细胞通过CDH1基因启动子甲基化下调E 银包金
cad蛋白表达，应用5 aza CdR可以逆转这种状态。 【关键词】 肝癌细胞 启动子甲基化 CDH1基因 5 氮 2′ 脱氧胞苷
启动子高甲基化是很多基因失活的原因，E 钙黏附素(E cad)蛋白在很多肿瘤细胞中失活，其与肿瘤的转移和侵袭能力相关。在很多上皮组织来源的肿瘤中已经发现E cad通过CDH1基因启动子甲基化而失活〔1〕。我们通过体外和体内实验验证肝肿瘤细胞的CDH1基因启动子的甲基化情况，并观察应用5 氮 2′ 脱氧胞苷(5 aza CdR)后肿瘤细胞的生物学活性变化。
1 材料与方法
1 1 细胞及主要试剂 肝癌细胞株7721吉林大学第一医院血液科惠赠，5 aza CdR购自Sigma公司(美国)，用二甲基亚砜溶解备用。体外实验用的5 aza CdR均为5 μmol/ L，检测药物干涉时间为用药后24 h。
1 2 细胞黏附实验 将2 0 μg 纤黏连蛋白和层黏连蛋白分别铺于96孔培养板中,室温干燥、蛋白封闭、洗涤后每孔加入5×104细胞,37 ℃培养1 5 h 后加入MTT，继续培养 4 h后于BIO RAD 550 酶标仪上测定A540 nm值。细胞黏附率以黏附细胞与总细胞A540 nm的比值来表示。
1 3 细胞侵袭试验 将Polycarbonate 滤膜贴于 transwell 细胞培养小室上,于滤膜上下分别涂纤维黏连蛋白和基质胶(matrigel)。取2 5 ×109 L-1 浓度的细胞100 μl 于transwell小室,37℃温育24 h后取出,甲醇固定后,用棉签擦去滤膜表面细胞,染、封片。400倍光镜下随机选择5个视野,计数每个视野细胞数目并计算细胞侵袭的百分率，重复做4次。
1 4 细胞迁移实验 取50 μl 4×109 L-1的细胞加入含187 5 μl胶原溶液(1 67 g/ml) 和25 μl
RPMI 1640混合液中。将此悬液加入自制的玻璃小室,置于37 ℃细胞培养温育30 min，用熔化至55 ℃左右的石蜡凡士林混合液(1∶1) 密闭玻璃小室。每次实验随机选择30个细胞,应用计算机辅助细胞跟踪系统分析细胞迁移百分率，重复做10次。
1 5 CDH1启动子甲基化分析 以常规酚/氯仿法从细胞中提取基因组DNA并采用甲基化特异性的PCR（MSP）检测。未甲基化的引物序列5′ GGTAGGTGAATTTTTAGTTAATTAGTGGTA甲胺基苯丙酮 3′(正义链),5′ ACCCATAACTAACCAAAAACACCA 3′(反义链),甲基化的引物序列为5′ GGTGAATTTTTAGTTAATTAGCGGTAC 3′(正义链)，5′ CATAACTAACCGAAAACGCCG 3′(反义链)。 DNA亚硫酸化修饰并纯化后进行PCR。正常对照组血液样品中的DNA 加入甲基转移酶作为甲基阳性对照。非甲基化的淋巴细胞DNA 作为阴性对照。25 μl 的样品在美国2400型PCR扩增仪上。变性：95℃ 30 s、退火57℃ 30 s、延伸72℃ 1 min。共进行35个循环。PCR产物在2%琼脂糖电泳110 V 20 min，溴化乙锭染，紫外分光光度仪下分析染强度。
1 6 免疫印迹(Western blot)方法检测用药前后CDH1的蛋白表达 取体外培养的瘤组织或1
×107～1×108个7721细胞在1 ml RIPA裂解缓冲液中匀浆提取蛋白,测定提取的蛋白浓度。每个上样孔加样30 μg 蛋白,经电泳、转膜后杂交,一抗为山羊抗大鼠CDH1单抗(Santa Cruz 公司,1∶400)，二抗为HRP 标记兔抗山羊IgG抗体( Santa Cruz 公司，1 ∶4 000 ),ECL显(Amersham 公司)，拍照,密度扫描测各条带吸光度( IA) 。以IA(目的条带/ 正常对照条带)，表达各标本上述蛋白含量，共重复10次。
1 7 肿瘤细胞裸鼠皮下成瘤能力 取30只4 周龄的雄性裸鼠,随机分成A、B、C 三组,每组10只。A 组皮下接种未经处理的7721单细胞悬液0 2 ml，B组接种经5 μmol/ L 的5 aza CdR处理24 h后浓度为1×107 ml-1的细胞悬液0 2 ml。C 组皮下注射PBS 溶液0 2 ml，6 w以后应用ELISA方法测量外周血E cad、E 选择素、甲胎蛋白(AFP)；处死小鼠后根据最大直径×横径2/2测肿瘤体积；并统计局部侵袭率、远处转移率。
1 8 统计学方法 计量资料以x±s表示，首先进行方差分析，根据方差分析结果选择应用t或t′检验，对表格计数资料采用χ2检验。
2 结果
2 1 细胞用药前后对细胞黏附、迁移、侵袭能力及CDH1蛋白表达的影响 见表1。
表1 用药前后细胞黏附、迁移、侵袭能力及CDH1蛋白表达情况（略）
与用药前相比较：1）P＜0 05
2 2 不同处理后小鼠外周血E cad 、E 选择素、AFP含量及肿瘤体积的变化 见表2。
表2 不同处理后小鼠外周血E cad 、E 选择素、AFP含量及肿瘤体积的变化（略）
与A组相比：1）P＜0 05
2 3 各组小鼠肿瘤发生的侵袭和转移情况 A组发生局部侵袭率（17/20，85 0%）和远处转移率(11/20,55 0%)要明显高于B组的局部侵袭率（8/20，40 0%）和远处转移率（4/20，20 0%）。
智力积木
2 4 5车架总成 aza CdR对癌细胞中启动子甲基化的影响 用药后MSP 方法未检测到细胞甲基化扩增,这个结果表明5 aza CdR逆转了肿瘤细胞启动子的的甲基化状态。
3 讨论
由CDH1基因表达的E cad蛋白在很多肿瘤组织中通常减少或缺失〔2〕,很多机制如基因突变、启动子高甲基化和转录抑制都与之有关。许多上皮来源的恶性肿瘤中均有CDH1表达缺失,其病理分级、浸润性生长、淋巴结转移和远处转移均与CDH1表达下调有关〔3，4〕 。我们研究发现肝癌细胞的E cad蛋白表达下降与CDH1基因启动子的甲基化相关，应用5 aza CdR可以逆转细胞启动子甲基化状态从而使E cad蛋白表达提高。5 aza CdR 作为脱氧胞苷类似物,可掺入DNA合成,从而降低了DNA 在甲基转移酶作用下接受甲基的能力〔5〕。 同时5 aza CdR与DNMTs 形成共价复合物,降低甲基转移酶（DNMTs） 的活性〔6〕。从而使某些因甲基化静止的基因重新激活。我们发现用药前后细胞的黏附、迁移、侵袭能力及E cad蛋白都发生了变化。用药后细胞的迁移、侵袭能力下降而黏附能力和CDH1蛋白增加。这说明用药后通过E cad蛋白表达增加而降低了细胞的恶性程度。先前的研究发现肝癌细胞较正常的肝组织细胞E cad蛋白表达缺失，这种缺失是通过CDH1基因启动子的甲基化而实现的。所以应用甲基化抑制剂后E cad蛋白的表达增加，增加的E cad蛋白加强了细胞与细胞之间的黏附，使细胞不易脱离肿瘤组织，同时也使细胞与细胞外基质的黏附性增强。这也可以解释为什么用药后迁移、侵袭能力下降而黏附能力增强。体内实验发现，处理后再接种的肿瘤组织发生的局部侵袭率和远处迁移率都明显低于未处理组。
同时处理组外周血可溶性的E cad 、E 选择素、AFP含量都高于处理组，值得指出的是，虽然在肿瘤细胞高表达E cad代表着低转移和侵袭性。但是因为高表达E cad有助于癌细胞与周围基质相互作用，形成和建立转移灶，还有利于癌细胞免受凋亡而存活，维持其间的黏附能力，阻止癌结构的松散。所以E cad表达的增高对肿瘤生物学影响应该综合两个方面分析。另外对于血清中可溶性E cad水平与肿瘤组织中表达E cad水平与肿瘤生物学特性的相关性也不一致。可能是因为血清中可溶性E cad水平是反映上皮性癌灶周围E cad的进行性再生的。已有研究表明血清可溶性E cad在恶性肿瘤患者的血清水平高于正常及良性者。在很多肿瘤中，血清可溶性E cad水平增高与肿瘤分化差、临床分期晚有关。我们研究发现反映免疫黏附的E cad和E 选择素在处理组中表达要低于非处理组。这不但说明血清可溶性E cad与肿瘤组织中表达的E cad生物学意义不同，同时也说明未处理组可能是通过这些分子与基质之间的黏附而促进肿瘤细胞的转移的。研究同时发现处理组的AFP及肿瘤体积要小于处理组，这说明未经去甲基化处理的肿瘤细胞增殖较快，分泌AFP入血增多。总之，肝癌细胞CDH1基因启动子高甲基化状态决定E cad表达下降，5 防潮密闭门aza CdR可以通过逆转高甲基化状态而改变肿瘤细胞生物学活性。
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