1. 引物设计：根据需要验证的基因序列，设计需要扩增的基因片段引物。引物设计方法如下： （1）引物 F：5’ 端 - 保护碱基序列 + 限制性内切酶 1 酶切位点序列 + 基因正向引物序列 - 3’端
saw 3d（2）引物 R：5’ 端 - 保护碱基序列 + 限制性内切酶 2 酶切位点序列 + 基因反向引物序列 - 3’
通过加入基因组 DNA 模板以及设计好的引物进行目的基因的扩增，得到 PCR 产物后进行琼脂糖凝胶电泳验证条带大小，然后通过胶回收，获得纯化目的片段产物。 由于加入保护碱基，回收产物需要进行限制性内切酶切从而暴露黏性末端。
2. 线性化质粒：将原始的质粒载体，比如 pcDNA3.1 质粒，选择合适的酶切位点，比如 NheI/KpnI 进行酶切，获得线性化的质粒 酶切体系一般选择 50ul，试剂加好之后 37°C 孵育 6~8 小时，或适当延长时间，保证质粒酶立方氮化硼砂轮
切完全。每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。酶切后载体通过切胶回收线性化载体
3. 质粒连接：将线性化的载体与目的基因的连接，推荐在 10~20μl 反应体系中进行连接反应，可以选择 T4 酶进行黏性末端的连接
4. 转化涂板：将连接产物转化到受体菌中（一般为 DH5a），涂板，培养过夜。次日，挑取平板上单克隆菌落进行摇菌, 送菌液测序，得到野生型质粒。
第二阶段: 突变型质粒构建
无水硫铝酸钙在得到野生型质粒之后，下一步就是对目的基因片段进行突变啦，即将目的基因上面的一个碱基或多个碱基换成另外的碱基
质粒突变的原理: 即通过设计引物, 并利用 PCR 将模板扩增出来, 待突变的质粒通常来源于大肠杆菌等细菌，在细菌中会被甲基化修饰，而在体外通过 PCR 扩增得到的质粒不会被甲基化
这样用甲基化酶 DpnI 酶处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过 PCR 扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。
1．突变引物设计: 向质粒进行单点或者多点突变，只需要设计一对引物，进行 PCR 的扩增，替换掉野生型基因的突变位点碱基。
(1) 通常突变引物长度为 25~45bp, 一般都是以要突变的碱基为中心, 各加上两边的一段序列, 两边长度至少为 10–15bp，同时合成反向互补的引物。
识字闪卡(2) 设计引物时最好将突变引物设在目的基因的中央位置。
(3) 设计引物时需要注意 GC 含量应大于 40%，Tm 值至少达到 78℃。
2．突变质粒的扩增：突变质粒的扩增过程中，需要选用高保真酶 Pfu 酶进行质粒扩增, 防止引进新的突变。通过 PCR 过程，突变型质粒也得到了扩增。
3. 得到 PCR 产物后，将产物立即置于冰上，然后在 PCR 反应体系中加入 1 微升 Dpn I，混匀后 37℃孵育 1-2 小时。DpnI 能够识别甲基化位点并将其酶切。从大肠杆菌里提取原双面绣是谁发明的>擦拭棒
始质粒模板一般都被甲基化的，DpnI 可以将原始野生型质粒模板进行酶切, 而质粒扩增的突变型质粒不能被酶切从而保留下来。
4. 最后，将酶切后产物转化入大肠杆菌，通过涂板挑取单克隆菌落后，摇菌测序，这样就可以得到突变基因的质粒啦。
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