分子机制研究套路（三）
课题： 受体A蛋白与真核翻译起始因子B相互作用的分子机制及功能研究
1．概念介绍：
众所周知，蛋白质是具有内在结构并能够发挥众多功能的一类生物大分子。蛋白质通常由二十种氨基酸通过不同的搭配组成，每一个蛋白质都是由一条或多条氨基酸分子形成的肤链组成。而多肤链中的氨基酸是由其对应的信使RNA(messenger RNA, mRNA)分子中的核酸基序决定的。mRNA分子要将自身携带的信息转化为不同功能的蛋白质，就必须通过翻译过程。整个翻译过程分为三步：翻译起始，翻译延伸和翻译终止。每一步过程都需要有许多蛋白质的参与，其中翻译的起始是整个过程的开端，意义重大。
翻译起始过程可被分为三步：首先，40S小亚基与翻译起始因子结合，在翻译起始因子的帮助下与mRNA模板结合；然后，在翻译起始因子和GTP的帮助下，Met-tRNA进入小亚基，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对；最后，由tRNA，mRNA，翻译起始因子
组成的小亚基复合物与大亚基结合，伴随着GTP的水解，并释放出翻译起始因子。
真核翻译起始因子(eukaryotic initiation factor，eIF)，是指参与和帮助真核细胞翻译起始这一过程的蛋白质。与原核翻译起始因子只有三种(IF1、IF2、IF3)相比，真核翻译起始因子种类多且复杂。通过这些真核翻译起始因子之间以及不同的真核翻译起始因子与其它细胞器或大分子(核糖体，mRNA，起始tRNA)之间的相互作用，来完成真核生物的翻译起始。对于真核生物来说，其翻译起始过程更多的依赖于蛋白质与蛋白质以及蛋白质与RNA之间的相互作用。
除了参与真核翻译起始进程之外，大多数真核翻译起始因子还有其他一些功能。比如参与细胞生长和细胞周期的调控，与某些疾病的发生相关等。
2．示意图：
3．研究思路：
3.1受体A与翻译起始因子B的相互作用
3.1.1酵母双杂交证实受体A-ICD（intracellular domain）与翻译起始因子B相互作用
受体A-ICD和l型匹配翻译起始因子B蛋白的自激活检测：
将质粒pAS2-l-受体A-ICD与pACT2-翻译起始因子B分别转化酵母宿主菌Y190，涂布于
SD/-Trp/-His+3-AT和SD/-Leu/-His+3-AT固体培养基上，7天后，未见有克隆生长。结果表明两种载体表达的融合蛋白都不能自主激活报告基因。
受体A-ICD与翻译起始因子B在酵母体系中相互作用的验证：
利用氯化裡转化方法，将PAS2-1-受体A-ICD与pACT2-翻译起始因子B两种载体同时转化
酵母宿主菌Y190，涂布于SD/-Trp/-Leu/-His+3-AT(25mM)固体培养基上，7天后有阳性克隆出现，直径大于2 mm，呈白，苗壮生长。转接到新鲜的SD/-Trp/-Leu/-His+3-AT(25 mM)固体培养基上，生长3-4天后，检测β-半乳糖苷酶活性。结果表明共转PAS2-1-受体A-ICD和pACT2-翻译起始因子B质粒的酵母菌株以及阳性对照菌株的检测结果为阳性(酵母裂解产物变蓝)，对照组结果均为阴性，表明在酵母体内受体A-ICD与翻译起始因子B能够相互作用。
钢管加工3.1.2GST pull -down验证受体A-ICD与翻译起始因子B的相互作用
一）GST-翻译起始因子B与HA-受体A-ICD 的相互作用
重组蛋白GST-翻译起始因子B在大肠杆菌中的诱导表达及纯化：
将重组质粒pGEX-6P-l-翻译起始因子B及空载体pGEX-6P-l各自转化菌株BL21，0.5 mmol/L的IPTG诱导16 h后，超声破碎菌体，将诱导前和诱导后的蛋白样品以及经Glutathione Sepharose 4B介质纯化的蛋白样品经SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝染，脱。含有重组质粒pGEX-6P-l-翻译起始因子B的宿主菌经超声破碎的裂解液上清在＿kDa位置略上处出现诱导表达带，与预期分子量基本一致，并且经Glutathione Sepharose 4B介质纯化后，可得到高纯度的融合蛋白GST-翻译起始因子B；而含pGEX-6P-l空载体的宿主菌裂解液上清中仅出现一条约26 kDa的诱导表达条带，经Glutathione Sepharose 4B介质纯化后，也可得到高纯度的GST蛋白。
GST pull-down实验证实受体A-ICD与翻译起始因子B能在体外结合：
使用IPTG诱导含有空载体PGEX-6P-1或重组质粒pGEX-6P-l-翻译起始因子B的大肠杆菌 BL21，表达GST蛋白和融合蛋白GST-翻译起始因子B，利用 Glutathione Sepharose 4B亲
和层析柱纯化GST和GST-翻译起始因子B。将重组质粒pCMV-HA-受体AICD瞬时转染HEK293T细胞，收集并裂解细胞，获得含有融合蛋白HA-受体AICD的细胞总蛋白。
将经过预清除的细胞总蛋白与结合有GST或GST-翻译起始因子B蛋白的Glutathione
Sepharose 4B于4°C温育过夜。样品处理后，进行SDS-PAGE，而后进行Western Blot分析。以anti-HA单抗检测HA-受体A-ICD，以考马斯亮蓝染检测纯化的GST和GST-翻译起始因子B，上样量为pull-down实验蛋白用量的1/20。结果发现纯化的GST-翻译起始因子B泳道中有一条分子量为＿kDa左右的特异性条带，其大小与HEK293T细胞裂解液中检测到的HA-受体A-ICD—致，而在GST泳道中则无任何条带，该结果表明纯化的GST-翻译起始因子B能结合HA-受体A-ICD，而纯化的GST则不能结合HA-受体A-ICD，由此表明受体A-ICD与翻译起始因子B在体外能进行特异性结合。
二）GST-受体A-ICD与Myc-翻译起始因子B的相互作用
重组蛋白GST-受体A-ICD的诱导表达及纯化
GST pull-down实验证实受体A-ICD与翻译起始因子B能在体外结合
环保材料服装注释：具体操作步骤同一），目的是为了双向验证2个蛋白可发生相互作用。
3.1.3水泥厂脱硝体外翻译系统证实受体A-ICD与翻译起始因子B在体外能直接相互作用
使用体外翻译系统TNT Quick Coupled Transcription /Translation Systems表达His-受体A-ICD；在大肠杆菌中诱导表达GST和GST-翻译起始因子B，而后将结合有 GST 或 GST-翻译起始因子B蛋白的Glutathione Sepharose 4B与 His-受体A-ICD 共同温育。细胞裂解液洗涤3次后，加入2XSDS上样缓冲液，沸水中加热5min，离心收集上清。进行SDS-PAGE，将蛋白转印到销酸纤维素膜上进行Western Blot分析。以anti-受体A检测His-受体A-ICD，以考马斯亮蓝染检测纯化的GST和GST-翻译起始因子B，上样量为pull-down实验蛋白用量的1/20。结果显示：纯化的GST-翻译起始因子B能结合His-受体A-ICD，而纯化的GST不能结合His-受体A-ICD，由此表明受体A-ICD与翻译起始因子B在体外能直接特异性结合。
3.1.4免疫共沉淀(Co-IP)验证受体A-ICD与翻译起始因子B的相互作用
为研究受体A-ICD与翻译起始因子B在体内的相互作，将pCMV-HA-受体A-ICD和pCMV-Myc-翻译起始因子B共转染HEK293T细胞，作为实验组；同时将pCMV-HA-受体A-ICD和p
CMV-Myc转染HEK293T细胞作为对照组，转染24 h后收获细胞。将裂解后的细胞总蛋白中加入anti-c-Myc温育后，protein G捕获免疫复合物。SDS-PAGE电泳后，将蛋白转印到销酸纤维素膜上进行Western Blot分析。anti-HA杂交后，可以检测到受体A-ICD的存在，而对照组则检测不到。反之，将裂解后的细胞总蛋白中加入anti-HA温育，anti-c-Myc杂交同样也可以检测到翻译起始因子B，而对照组则检测不到。两个方向的免疫共沉淀结果表明，在细胞内受体A-ICD与翻译起始因子B可以相互作用。新型模板支撑
3.2受体A-ICD与翻译起始因子B相互作用的定位
3.2.1翻译起始因子B通过其N端与受体A-ICD相互作用
GST pull-down实验证实翻译起始因子B通过其N端与受体A-ICD相互作用：
表达 GST 蛋白、GST-翻译起始因子B-NTD（N端截短体）和翻译起始因子B-CTD（C端截短体），利用 Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化GST、GST-翻译起始因子B-NTD和GST-翻译起始因子B-CTD。将重组质粒pCMV-HA-受体A-ICD瞬时转染HEK293T细胞,收集并裂解细胞，获得含有融合蛋白HA-受体A-ICD的细胞总蛋白。
将经过预清除的细胞总蛋白与结合有GST、GST-翻译起始因子B-NTD或GST-翻译起始因子B -CTD蛋白的Glutathione Sepharose 4B于4°C温育过夜，样品处理后，进行Western Blot分析。以anti-HA单抗检测HA-受体A-ICD，以考马斯亮蓝染检测纯化的GST和GST-翻译起始因子B-NTD或GST-翻译起始因子B-CTD，上样量为pull-down实验蛋白用量的1/20。结果显示只有纯化的GST-翻译起始因子B-NTD泳道中有一条分子量与HEK293T细胞裂解液中检测到的HA-受体A-ICD—致的条带，而在GST和GST-翻译起始因子B-CTD泳道中则无任何条带，所以该结果表明纯化的GST-翻译起始因子B-NTD闪光棒能结合HA-受体AICD，而纯化的GST和GST-翻译起始因子B-CTD 则不能结合HA-受体AICD，由此表明翻译起始因子B通过其N端与受体A-ICD相互作用。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议