目的：建立苯甲醇微生物限度检查法并進行方法适用性实验。方法：按《中国药典》2015年版四部制剂通则1105、1106、1107项下要求进行实验。需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查和控制菌检查均采用薄膜过滤法，采用上述方法对苯甲醇药用辅料各实验菌进行回收率实验，并对控制菌检查方法进行适用性实验。结果：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数验证实验中各菌的回收比值均符合《中国药典》2015年版规定，控制菌检查方法可行。结论：该方法适用于苯甲醇辅料的微生物限度检查。 微生物檢查作为药品安全的重要指标，其标准制定也随着药品产业的发展及对药品质量高要求的需求而不断提高。2015年版《中国药典》对微生物限度检查法做了较大的修订，新版药典将2010年版药典附录中的Ⅺ J微生物限度检查法拆分为三个部分，分别为微生物计数法、控制菌检查法和微生物限度标准[1]。其中检验所用实验菌液、检验方法、培养基、培养温度等都做了不同程度的更改。新版药典更加关注生产过程中的微生物控制，在药品生产、储藏和流通各个环节中，药品生产企业均应严格遵循GMP的指导原则。制剂、原料及辅料、中药提取物及中药饮片的微生物限度与2010年版《中国药典》比较给出了具体的限度标准。本文 按照2015年版《中国药典》的操作要求及指导原则，对苯甲醇药用辅料微生物限度检查法进行研究及适用性实验，以确定出适宜、有效的检查方法[2]。苯甲醇也称苄醇，英文名Benzyl alcohol，是最简单的含有苯基的脂肪醇，苯甲醇为无颜透明液体，有微弱的芳香气味，稍溶于水，易溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂[3-4]。苯甲醇用途广泛，主要应用于环氧树脂及涂料领域，也广泛应用于日化、食品、医药等领域。近年来随着相关行业的发展，国内外对苯甲醇的需求量不断增加，2011年医药领域苯甲醇的消费量约为1200 t。由于其具有麻醉、镇痛的功效，苯甲醇在制剂中用作防腐剂和局部止痛剂，但因不良反应较大，婴儿使用时有过致死案例，目前主要用作防腐剂。塑料制油
1 仪器与材料
1.1 仪器 BKQP-50L型高压蒸汽灭菌器（济南博鑫生物技术有限公司）；M1-211A微波炉（美的集团有限公司）；XP-S电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；SW-CJ-2D净化工作台（苏州净化有限公司）；Heal Force-900C 生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）；HWS-250恒温恒湿实验箱（天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司）；3758CN低温培养箱（赛默飞世尔科技中国有限公司）；HH.S21-6电热恒温水浴锅（上海实业有
限公司）；ZW-2008智能集菌仪（温州维科生物实验设备有限公司）；薄膜过滤器（浙江泰林生物技术股份有限公司）。
1.2 主要试剂 苯甲醇，批号：20151201、20151202、20151203三个批次，由江西阿尔法高科药业有限公司提供；培养基有：胰酪大豆胨液体培养基，批号160119；胰酪大豆胨琼脂培养基，批号160128；沙氏葡萄糖琼脂培养基，批号160119；沙氏葡萄糖液体培养基，批号151222；肠道菌增菌液体培养基，批号：160203；紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基，批号160614；麦康凯液体培养基，批号160511；麦康凯琼脂培养基，批号160511；甘露醇氯化钠琼脂培养基，批号151124；溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，批号151102，以上培养基均来源于北京陆桥技术有限责任公司。实验菌种有：枯草芽孢杆菌[CMCC（B） 63501]、金黄葡萄球菌[CMCC（B） 26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B） 10104]、大肠埃希菌[CMCC（B） 44102]、白念珠菌[CMCC（F） 98001]、黑曲霉[CMCC（F） 98003]，以上菌种均购自中国药品生物制品检定所。1.3 验证方法
1.3.1 实验菌株菌液制备 将金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的胰酪大豆胨液体培养基置35 ℃培养24 h，分别取以上新鲜培养物各1 mL，用0.9%无菌
氯化钠溶液10倍稀释至10-3～10-7，做活菌计数备用。将白念珠菌的沙氏葡萄糖液体培养基置25 ℃培养2 d，取新鲜培养物1 mL，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-2～10-4，做活菌计数备用。将黑曲霉的沙氏葡萄糖琼脂培养基置25 ℃培养7 d，加5 mL 0.9%无菌氯化钠溶液将黑曲霉孢子洗脱，吸取出孢子悬液1 mL，用0.9%无菌氯化钠溶液适量稀释，用标准比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相比后，取1 mL稀释后的孢子悬液，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-2～10-4，做活菌计数备用。
1.3.2 供试液制备 取供试品10 mL，置无菌锥形瓶中，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100 mL，混匀，作為1∶10供试液，备用。
1.3.3 细菌、霉菌及酵母菌数计数适用性实验
1.3.3.1 实验组 （1）需氧菌计数：取上述1∶10供试液1 mL，置薄膜过滤器中，采用薄膜过滤法，每筒用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，在最后一次冲洗液中加入不大于100 cfu的实验菌（金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白念珠菌、黑曲霉），滤干，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂平板上，实验平板置35 ℃培养箱培养。金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌培养3 d，白念珠菌、黑曲霉
分别培养5 d，逐日观察平板生长情况。（2）霉菌和酵母菌计数：取上述供试液10 mL，置薄膜过滤器中，采用薄膜过滤法，每筒用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，在最后一次冲洗液中加入不大于100 cfu的实验菌（白念珠菌、黑曲霉），滤干，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂平板上，实验平板置25 ℃培养箱培养5 d，逐日观察平板生长情况。
1.3.3.2 供试品对照组 取上述1：10供试液，以稀释液代替菌液，同实验组操作，测定供试品本底菌落数。
欧姆接触
1.3.3.3 菌液对照组 取相应稀释液替代供试液，同实验组操作加入实验菌液并进行微生物回收实验。
1.3.3.4 判断标准 计数方法适用性实验中，实验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。
1.3.4 控制菌检查方法的适用性实验
1.3.4.1 金黄葡萄球菌检查 实验组：取上述1∶10供试液10 mL，置薄膜过滤器中，采用
薄膜过滤，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，加入不大于100 cfu金黄葡萄球菌实验菌（将实验菌加入最后一次冲洗液中），取膜置于100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，35 ℃培养24 h，取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，35 ℃培养72 h，观察平板生长情况。阴性对照组：取稀释液10 mL替代1∶10供试液，照金黄葡萄球菌检查法操作。
1.3.4.2 铜绿假单胞菌检查法 实验组：取上述1∶10供试液10 mL，置薄膜过滤器中，采用薄膜过滤，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，加入不大于100 cfu铜绿假单胞菌实验菌（将实验菌加入最后一次冲洗液中），取膜置于100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，35 ℃培养24 h，取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，35 ℃广告检测培养72 h，观察平板生长情况。阴性对照组：取稀释液10 mL替代1∶10供试液，照铜绿假单胞菌检查法操作。
1.3.4.3 大肠埃希菌检查法 实验组：取上述1∶10供试液10 mL，置薄膜过滤器中，采用薄膜过滤法，每筒用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，滤干，取膜置于100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，同时加入不大于100 cfu的大肠埃希菌液，35 ℃培养24
h，取上述培养物1 mL接种至100 mL麦康凯液体培养基中，42 ℃培养24 h。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上，35 ℃培养48 h。取麦康凯琼脂平板上菌落划线接种于营养琼脂平板进行分离纯化，经纯化后的培养物，接种至含5 mL MUG培养基的试管内，培养，于5、24 h在366 nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培養基作本底对照。观察后，沿管壁加入数滴靛基质试液，观察MUG培养基颜变化。阴性对照组：取稀释液10 mL替代1∶10供试液，照大肠埃希菌检查法操作。
贴片线圈
1.3.4.4 耐胆盐革兰阴性菌检查法 实验组：将上述1：10供试液置于25 ℃预培养2 h。取上述预培养供试液10 mL（2份），置薄膜过滤器中，采用薄膜过滤法，每筒用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，分别加入不大于100 cfu的大肠埃希菌液和不大于100 cfu的铜绿假单胞菌液（将实验菌液加入最后一次冲洗液中），取膜置于100 mL肠道菌增菌液体培养基中，35 ℃培养箱中培养48 h后，上述培养物划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，置35 ℃培养24 h，观察平板生长情况。若紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长，代表检出耐胆盐革兰阴性菌。阴性对照组：取稀释液10 mL替代1∶珊瑚姜10供试液，照耐胆盐革兰阴性菌检查法操作。
2 结果
2.1 需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法适用性实验结论 在三次独立的需氧菌计数方法适用性实验中，5种菌株的回收比值均在0.5～2.0范围内，符合药典规定。因此可照此方法测定苯甲醇的需氧菌总数。在三次独立的霉菌和酵母菌计数方法适用性实验中，白念珠菌和黑曲霉的回收比值均在0.5～2.0范围内，符合药典规定。因此可照此方法测定苯甲醇的霉菌和酵母菌总数。见表1。2.2 控制菌检查方法学适用性实验结论 在进行金黄葡萄球菌检查、铜绿假单胞菌检查、大肠埃希菌检查和耐胆盐革兰阴性菌检查四种控制菌的适用性实验中，实验组均检出阳性实验菌，阴性对照组无菌生长。因此，可照此方法进行苯甲醇的控制菌检查。见表2～5。
3 讨论
与2010年版药典相比，2015年版药典在微生物控制方面做了很大幅度的改变。新版药典将“方法验证”改为了“方法适用性”，适用性是把实验条件、供试品等因素作为一个整体来评价，更为完整科学。新版药典中的培养体系也有变化，首先是培养基的改变，需氧菌计数所使用的培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基[5-9]，霉菌和酵母菌计数使用沙氏葡萄糖琼脂培养基。培养温度也做出了适当的调整，需氧菌计数培养温度由35～37 ℃调整为30～35 ℃扩音喇叭，
霉菌和酵母计数培养温度由25～28 ℃变为20～25 ℃。测试菌株也发生了改变，采用金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌三株菌进行方法适用性实验，其中铜绿假单胞菌替换了2010版药典中的大肠埃希菌。而且需氧菌计数的适用性实验中，需要使用5种菌株，相较于2010版药典的3菌株增加了白念珠菌和黑曲霉[10-11]。此外，计数回收方法中增加了新的检测方法-MPN法，可作为平板计数法和薄膜過滤法不适用时的补充。
控制菌检查方面，新版药典控制菌检查法除梭菌和白念珠菌外，其余检查指标在预培养和增菌培养这一步骤中都统一使用了胰酪大豆胨液体培养基，大大方便了实验操作。新版药典新增了耐胆盐革兰阴性菌的检查，替代了《中国药典》2010年版的大肠菌的检查。在各控制菌项下，生化实验和“应进行分离、纯化及适宜的鉴定实验”改为“采用其他适宜方法进一步鉴定”，检测方法更加灵活多变，实验室可以根据自身情况灵活选择适宜的方法，调高检验效率和结果可靠性[12-14]。
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