虫堡捡堕医堂盘盍型！生！Ｑ旦筮！！鲞筮！Ｑ翅堡！也』！坐丛鲤：堡垫！璺！呈鲤！：！吐！！，盟垒！Ｑ
．临床实验诊断研究．
碳青霉烯酶的检测油水冷却器
张嵘蔡加昌周宏伟陈功祥
【摘要】目的研究重症监护病房（ＩＣＵ）出现的碳青霉烯耐药的黏质沙雷菌、肺炎克雷伯菌和 大肠埃希菌等肠杆菌科细菌的分子流行病学及耐药机制。方法２００６年４月—２００ｒ７年２月，从我院
２个ＩＣＵ病房分离到对碳青霉烯耐药或敏感性降低的２１株黏质沙雷菌、１０株肺炎克雷伯菌和ｌ株大
肠埃希菌。用脉冲场凝胶电泳（ＰＦＧＥ）和肠杆菌基因间重复性一致序列一ＰＣＲ（ＥＲＩＣ—ＰＣＲ）分析这些
菌株的分子流行病学。用接合试验、质粒消除试验、质粒图谱分析、等电聚焦电泳（ＩＥＦ）、特异性ＰＣＲ 扩增和序列分析以及外膜蛋白分析等技术研究细菌对碳青霉烯耐药的分子机制。结果２１株黏质
沙雷菌为同一克隆株；１０株肺炎克雷伯菌亲缘关系相近。亚胺培南和美罗培南对黏质沙雷菌、肺炎
克雷伯菌和大肠埃希菌的ＭＩＣ为２～８斗ｇ／ＩＩｌｌ，肺炎克雷伯菌Ｋ１０为１２８和２５６斗ｇ／ｍｌ。所有菌株接
合试验均获得成功，亚胺培南和美罗培南对接合子的ＭＩＣ由原来的≤０．１２５ｏｅ，／ｍｌ上升到１—
２∥ｌｎｌ。ＩＥＦ、ＰＣＲ扩增和序列分析证实黏质沙雷菌产ＫＰＣ－２型碳青霉烯酶［等电点（ｐ１）为６．７］和ｐＩ
为６．５的Ｂ内酰胺酶；肺炎克雷伯菌产ＴＥＭ－Ｉ（ｐＩ５．４）、ＫＰＣ－２、ＣＴＸ－Ｍ－１４（ｐ１７．９）和ｐＩ为７．３的Ｂ内
酰胺酶；大肠埃希菌产ＫＰＣ－２、ＣＴＸ．Ｍ．１５（ｐＩ９．０）和ｐＩ为７．３的Ｂ内酰胺酶；所有接合子均只产
ＫＰｃ－２一种Ｂ内酰胺酶。所有接合子质粒ＤＮＡ的ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ１１Ｉ和ＢｃｕＩ限制性酶切图谱完全相
同。外膜蛋白的十二烷基磺酸钠．聚丙烯酰胺电泳和基因序列分析发现肺炎克雷伯菌ＫＩＯ由于
ＯｍｐＫ３６基因中存在插人序列ＩＳＥｅｐｌ而导致ＯｍｐＫ３６膜孔蛋白的缺失。结论我院ＩＣＵ病房出现大
量碳青霉烯耐药的黏质沙雷菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌；ＫＰＣ－２是引起这些细菌对碳青霉烯耐药
或敏感性降低的主要原因；ＫＰＣ－２合并膜孔蛋白缺失可导致肺炎克雷伯菌对碳青霉烯高水平耐药；同
一种编码ｂｌａ。Ｐｃ之的质粒在３种不同属的细菌之间传播。
【关键词】肠杆菌科；质粒；细菌蛋白质类；１３内酰胺酶类；卡巴配能类；抗药性，
细菌
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｌａｓｍｉｄ—ｍｅｄｉａｔｅｄｃａｒｂａｐｅｎｅｍ－ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇｐｌａｃｔａｍａｓｅＫＰＣ－２ｉｎＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ
树脂制品
ｚＨＡＮＧＲｏｎｇ，ＣＡ／Ｊｉａ－ｃｈａｎｇ，ＺＨＯＵＨｏｎｇ—ｗｅｉ，ＣＨＥＮＧｏｎｇ－ｘｉａｎｇ．ＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｅｎｔｅｒ，２ｒｉｄ
Ａｊ够ｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１０００９，Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＺＨＡＮＧＲｏｎｇ，Ｅｍａｉｌ：ｂｒｉｇｉｔｔｅｚｘ＠ｉ６３．ｃｏｒｎ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ｏｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｅａｒｂａｐｅｎｅｍ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＳｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ，ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅａｎｄＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍｉｎｔｅｎｓｉｖｅｃａｒｅ
水处理控制器
ｕｎｉｔｓ（ＩＣＵｓ）．ＭｅｔｈｏｄｓＴｗｅｎｔｙ．ｏｎｅＳ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ．ｔｅｎＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅａｎｄｏｎｅＥ．ｃｏｌｉｉｓｏｌａｔｅｓｗｉｔｈ
ｃａｒｂａｐｅｎｅｍｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｒｒｅｄｕｃｅｄｃａｒｂａｐｅｎｅｍｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｗｅｒｅｒｅｃｏｖｅｒｅｄｆｒｏｍｔｗｏＩＣＵｓｉｎｏｕｒｈｏｓｐｉｔａｌ
ｆｒｏｍＡｐｒｉｌ２００６ｔｏＦｅｂｒｕａｒｙ２００７．Ｐｕｌｓｅｄ．ｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＦＧＥ）ａｎｄｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ
ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｃｏｎｓｅｎｓｕｓ－ＰＣＲ（ＥＲＩＣ－ＰＣＲ）ｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｏｆｉｓｏｌａｔｅｓ．
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｉｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙａｇａｒｄｉｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｃｏ．ｊｕｇａｔｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔ
ｉｎｍｉｘｅｄｂｒｏｔｈｃｕｌｔｕｒｅｓ．ＰｌａｓｍｉｄＤＮＡＷＳＳｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｕｓｉｎｇａｎａｌｋａｌｉｎｅｌｙｓｉｓｔｅｅｈｎｉｑｕｅａｎｄｗａｓｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙ
ｖａｒｉｏｕｓｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．ＥｌｉｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｌａｓｍｉｄｆｒｏｍＳ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｂｙｒｅｐｅａｔｅｄＳＤＳ
ｔｒｅａｔｍｅｎＬＴｈｅｃｒｕｄｅＢ．１ａｃｔａｍａｓｅｅｘｔｒａｃｔｓｏｆｏｒｉｇｉｎａｌｉｓｏｌａｔｅｓａｎｄＥ．ｃｏｌｉｔｒａｎｓｅｏｎｊｕｇａｎｔｓｗｅｒｅｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏ
ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｆｏｃｕｓｉｎｇ（ＩＥＦ）；ＳｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲｓａｎｄＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗｅｒｅｐｒｅｆｏｒｍｅｄｔｏｃｏｎｆｉｒｍｔｈｅｇｅｎｏｔｙｐｅｏｆ
Ｂ．１ａｃｔａｍａｓｅｓ．ＲｅｓｕｌｔｓＥＲＩＣ．ＰＣＲｉｎｄｉｅａｔｅｄｔｈａｔａｌｌＳ．ｎ＇ｌ鲫ｃｅｓｃｅｎｓｉｓｏｌａｔｅｓｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏａｃｌｏｎａｌｓｔｒａｉｎ．
ＰＦＧＥｉｎｄｉｅａｔｅｄｔｈａｔｔｅｎｌＣｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅｉｎｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈａｂｌｅｏｒｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｅａｃｈｏｔｈｅｒ．７１１ｌｅ
ＭＩＣｓｏｆｉｍｉｐｅｎｅｍａｎｄｍｅｒｏｐｅｎｅｒｏｆｏｒａｌｌｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅ２ｔｏ８彬Ｉｎｌ
ｅｘｃｅｐｔ
ｋｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＫ１０（１２８ａｎｄ
２５６ｏｅ，／ｍｉ）．ＣｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｓｔｕｄｉｅｓｗｉｔｈＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ６００）ｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｒｅｄｕｃｅｄｅａｒｂａｐｅｎｅｍ
作者单位：３１０００９杭州，浙江大学医学院附属第二医院检验科
通讯作者：张嵘，：ｂｒｉｇｉｕｅ＿ｚｘ＠１６３．ｏＤｍ
生堡拴墅匡堂苤查塑！生！Ｑ旦筮！！鲞箍！Ｑ翅ｇ堕垫』！生丛鱼：Ｑ！虫坠竺至塑！：坠！！！，塑垒！Ｑ
ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｆｒｏｍｏｒｉ乎ｎａｌｉｓｏｌａｔｅｓ（ＭＩＣｓ：ｆｒｏｍ≤０．１２５¨ｅ，／ｍｌｔｏ１－２蜡／ｍ１）．ＩＥＦ，ＰＣＲａｎｄＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｍｉｓｏｌａｔｅｓｐｒｏｄｕｃｅｄＫＰＣ－２（ｐＩｏｆ６．７）ａｎｄａＢ－ｌａｃｔａｍａｓｅ（ｐＩ６．５）．ｋｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｉｓｏｌａｔｅｓｐｒｏｄｕｃｅｄＴＥＭ一１（ｐＩ５．４），ＫＰＣ－２，ＣＴＸ－Ｍ一１４（ｐＩ７．９），ａｎｄａＢ—ｌａｃｔａｍａｓｅ（ｐＩ７．３）．Ｅ．ｃｏｌｉＥｌｐｒｏｄｕｃｅｄＫＰＣ－２，ＣＴＸ—Ｍ－１５（ｐＩ９．０），ａｎｄａｐ－ｌａｅｔａｍａｓｅ（ｐＩ７．３）．ＯｎｌｙａＫＰＣ－２ｗａｓ
ｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎＥ．ｃｏｌｉｔｒａｎｓｅｏｎｊｕｇａｎｔｓ．ＰｌａｓｍｉｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，
ａｎｄＢｃｕＩｓｈｏｗｅｄｉｄｅｎｔｉｃａｌｒｅｓｔｒｉｅｔｉｏｎ
ｐａｔｔｅｒｎｓａｍｏｎｇａｌｌＥ．ｃｏｌｉ咖ｓｃｏｎｊｕｇａｎｔｓ．ＳＤＳ・ＰＡＧＥａｎｄｏｍｐＫ３５／３６ｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＯＭＰｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｋｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＫＩＯｆａｉｌｅｄｔｏｅｘｐｒｅｓｓＯｍｐＫ３６ｂｅｃａｕｓｅｏｆｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｂｙａｎｉｎｓｅｒｔｉｏｎｏｆＩ
ＳＥｃｐｌ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓＣａｒｂａｐｅｎｅｍ—ｎｏｎ—ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ．ＫｐｎｅｕｍｏｎｉａｅａｎｄＥ．ｃｏｌｉｗｅｒｅｅｐｉｄｅｍｉｃｉｎｔｗｏＩＣＵｓｉｎｏｕｒｈｏｓｐｉｔａＬＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｒｒｅｄｕｃｅｄｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｏｃａｒｂａｐｅｎｅｍｓｉｎｔｈｅｓｅｓｔｒａｉｎｓｉｓｍａｉｎｌｙｄｕｅｔｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＫＰＣ－２．ＰｒｅｓｅｎｃｅｏｆＫＰＣ－２ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｐｏｒｉｎｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｒｅｓｕｌｔｉｎｈｉＩｇｈ－ｌｅｖｅｌｃａｒｂａｐｅｎｅｍｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｋｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．’ｎｌｅ８ａｎｌｅｂｌａＫＰｃ。一ｅｎｃｏｄｉｎｇｐｌａｓｍｉｄｓｐｒｅａｄｓａｍｏｎｇｔｈｅｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｅｎｅｒａ．
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ；Ｐｌａｓｍｉｄｓ；Ｂａｃｔｅｒｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｓ；ｂｅｔａ—Ｌａｃｔａｍａｓｅｓ；
Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍｓ；Ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｂａｃｔｅｒｉａｌ
碳青霉烯类抗生素对大多数Ｂ内酰胺酶包括超广谱Ｂ内酰胺酶（ＥＳＢＬｓ）和ＡｍｐＣ酶都很稳定，被认为是目前临床上控制革兰阴性菌感染最有效的抗生素。临床上碳青霉烯耐药的肠杆菌科细菌非常少见。然而，随着这类抗生素使用的增加，耐药菌株不断出现，给临床和院内感染控制带来
极大困难。引起肠杆菌科细菌对碳青霉烯耐药的最常见原因是碳青霉烯酶的产生，其中关于ＫＰＣ的报道近几年逐渐增多，越来越引起人们的重视。
ＫＰＣ是近几年发现的一种新型碳青霉烯酶，属于Ｂｕｓｈ分类的２ｆ组，Ａｍｂｌｅｒ分类的Ａ类。Ｙｉｇｉｔ等…于２００１年首先报道在美国北卡罗来纳的肺炎克雷伯菌中发现ＫＰＣ—ｌ。２００３年ＫＰＣ－２在马里兰的肺炎克雷伯菌中被发现心Ｊ。此后在肠沙门菌∞Ｊ、产酸克雷伯菌ＨＪ、肠杆菌属细菌∞１等不同的肠杆菌科细菌中相继检测到ＫＰＣ－２。之后又在纽约的肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌中发现ＫＰＣ－３【６刁Ｊ。最近法国旧Ｊ、南美旧１和以列¨训也分离到产ＫＰＣ－２的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌。２００６年国内首次报道在ｌ株肺炎克雷伯菌中检测到ＫＰＣ－２【ｌ¨。值得注意的是，文献多次报道产Ⅺ）Ｃ的肺炎克雷伯菌在美国纽约引起流行∞，１２４３｜。
此前我们报道在２００６年２月从本院脑科重症监护病房一患者痰液标本分离到１株产ＫＰＣ－２的黏质沙雷菌¨４Ｉ。在随后不到１年的时间里，我们在脑科和外科２个重症监护病房分离到２１株黏质沙雷菌、１０株肺炎克雷伯菌和１株大肠埃希菌，这些菌株对碳青霉烯类抗生素表现为耐药或敏感性降低。实验发现，所有菌株均产ＫＰＣ－２，黏质沙雷菌和肺炎克雷伯菌分别属于同一克隆株。
移动门
材料与方法
一、材料
１．菌株来源：２００６年４月＿２００７年２月，从浙江大学医学院附属第二医院脑科重症监护病房患者痰液中分离到２１株黏质沙雷菌（菌株号Ｓ１一￥２１）；１０株肺炎克雷伯菌（菌株号Ｋ１～Ｋ１０）分别来自脑科重症监护病房（８株）和外科重症监护病房（２株）的痰液（６株）、血液（２株）、创面分泌物（１株）和静脉置管（１株）；１株大肠埃希菌（菌株号Ｅ１）来自脑科重症监护病房的痰液。
２．试剂和仪器：Ｖｉｔｅｋ细菌鉴定仪：法国ＢｉｏＭ６ｒｉｅｕｘ公司；ＲｏｔａｐｈｏｒＳｙｓｔｅｍ６．０脉冲场凝胶电泳仪：德国ＷｈａｔｍａｎＢｉｏｍｅｔｒａ公司；ＯｐｔｉｍａＭＡＸ超速离心机：美国ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ公司；ＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎ３垂直电泳仪：美国Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司；ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００型ＰＣＲ仪、ＡＢｌ３７３０型ＤＮＡ自动测序仪：美国ＡＢＩ公司；ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ等电聚焦电泳仪：瑞典ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ公司；等电聚焦电泳用ＰｈａｓｔＧｅｌ聚丙烯酰胺凝胶（ｐＨ３～９）：瑞典ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司；头孢硝噻吩（Ｎｉｔｒｏｃｅｆｉｎ）：英国Ｏｘｏｉｄ公司；基因组ＤＮＡ提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒（ＳＤＳ碱裂解法）：美国Ａｘｙｇｅｎ公司；限制性内切酶、蛋白质分子量标准：立陶宛Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司；蛋白质定量检测试剂盒：美国Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司。
二、方法
１．药物敏感试验：采用Ｍ—Ｈ琼脂稀释法测定抗生素ＭＩＣ，具体方法参照美国临床和实验室标准协会（ＣＬＳＩ）推荐方法¨５｜。
２．染体ＤＮＡ同源性分析：用脉冲场凝胶电泳（ＰＦＧＥ）对１０株肺炎克雷伯菌进行染体ＤＮＡ同源性分析，具体操作步骤参见美国ＣＤＣ网站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｐｕｌｓｅｎｅｔ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｈｔｍ）ｏ细菌的染体ＤＮＡ经ＸｂａＩ限制性内切酶消化后在ＲｏｔａｐｈｏｒＳｙｓｔｅｍ６．０脉冲场凝胶电泳仪上进行电
生堡捡验匡堂盘盍；螋！生！Ｑ臼筮！！鲞筮！Ｑ翅堡！也』！坐丛盟：坐！！垒竺兰ＱＱ§，№Ｌ≥！，盟垒！Ｑ
泳。电泳完成后溴化乙锭染，紫外灯下观察结果。根据Ｔｅｎｏｖｅｒ等¨钊的标准判读结果。
用肠杆菌基因间重复性一致序列－ＰＣＲ（ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌＲｅｐｅｔｉｔｉｖｅＩｎｔｅｒｇｅｎｉｅＣｏｎｓｅｎｓｕｓ－ＰＣＲ，ＥＲＩＣ—ＰＣＲ）对２１株黏质沙雷菌进行同源性分析。所用ＰＣＲ引物见表１。ＰＣＲ扩增条件为：９５ｏＣ预变性７ｍｉｎ；９４℃变性ｌｍｉｎ，４８℃退火ｌｍｉｎ，６５℃延伸４ｍｉｎ，３０个循环；最后６５℃延伸１６ｍｉｎ。
３．接合试验及质粒酶切图谱分析：受体菌为利福平耐药的大肠埃希菌ＥＣ６００。供体菌和受体菌分别接种于５ｍｌＭ—Ｈ肉汤培养基，３７℃摇床过夜；吸取２００ｇ，１供体菌、１００灿ｌ受体菌和６００肛ｌ新鲜Ｍ—Ｈ肉汤培养基，混合后置３７℃孵箱过夜培养；取一定量接合前和接合后菌液接种筛选平板（０．５斗ｇ／ｍｌ亚胺培南＋７００斗ｇ／ｍｌ利福平），３７℃孵箱过夜培养；挑取单菌落转划筛选平板，３７℃孵箱过夜培养。用Ｖｉｔｅｋ对接合子作生化鉴定。
碱裂解法提取黏质沙雷菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌及其接合子的质粒ＤＮＡ，方法参照试剂盒说明书。用ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ１１Ｉ和ＢｃｕＩ等限制性内切酶对接合子的质粒ＤＮＡ进行酶切，具体步骤参照产品说明书。
４．Ｂ内酰胺酶的等电聚焦分析（ＩＥＦ）：超声破碎法获取细菌酶粗提液，以ＰｈａｓｔＧｅｌ聚丙烯酰胺凝胶为载体，在ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ电泳仪上进行等电聚焦电泳，电泳完成后用头孢硝噻吩显。具体操作参照文献［１７］。待测酶的等电点（ｐＩ）与已知ｐ内酰胺酶ＴＥＭ一１（ｐＩ５．４）、ＴＥＭ－２８（ｐｌ６．１）、ＳＨＶ－７（ｐＩ７．６）和ＡＣＴ－１（ｐＩ９．０）的ｐＩ比较后确定。
５．黏质沙雷菌质粒消除试验：选择３株黏质沙雷菌（ｓ５，Ｓ１０和Ｓ１５）进行质粒消除试验。细菌接种于５ｍｌＭ．Ｈ肉汤培养基中，３７℃摇床过夜，吸取５０斗ｌ该肉汤增菌液于５ｍｌ含１
％十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）的新鲜Ｍ—Ｈ肉汤培养基中，３７℃摇床过夜，再吸取５０斗ｌ该肉汤增菌液于５ＩＩｌｌ含１％ＳＤＳ的新鲜Ｍ—Ｈ肉汤培养基中，３７℃摇床过夜，如此反复若干次。上述菌液划Ｍ—Ｈ琼脂平板分离出单个菌落，挑取其中若干菌落做纸片法药敏试验，亚胺培南敏感者疑为质粒丢失，碱裂解法提取质粒证实质粒是否被消除。
６．Ｂ内酰胺酶基因的特异性ＰＣＲ扩增及序列分析：以黏质沙雷菌和肺炎克雷伯菌及其接合子的质粒ＤＮＡ为模板，用ｂｌａＫＰｃ、ｂｌａＴｚＭ、ｂｌａｓ｜Ｉ、ｒ和ｂｌａ傩Ｍ等基因的引物进行ＰＣＲ扩增。引物序列及相关信息如表１。ＰＣＲ扩增产物用ＡＢｌ３７３０测序仪测序，所得ＤＮＡ序列与ＧｅｎＢａｎｋ中的数据库进行在线比对。
７．外膜蛋白分析：肺炎克雷伯菌ＡＴＣＣｌ３８８３用于外膜蛋白分析的对照菌株。参照文献［２１］提取肺炎克雷伯菌ＡＴＣＣｌ３８８３、Ｋ１和Ｋ１０的外膜蛋白。简要步骤如下：收集２００ｍｌ过夜培养的菌液；沉淀悬于Ｔｒｉｓ—Ｍｇ缓冲液，超声破碎细菌；３０００×ｇ４℃离心１０ｍｉｎ去除未破碎细菌；１０００００×９４ｏＣ离心６０ｒａｉｎ，收集沉淀，用含２％十二烷基肌酸钠的Ｔｒｉｓ—Ｍｇ缓冲液重悬沉淀，室温放置３０ｍｉｎ，重复该步骤２次；沉淀中加入适量去离子水，一８０℃保存备用。外膜蛋白浓度采用考马斯亮蓝法测定，蛋白上样量约为３斗ｇ。所提取外膜蛋白溶解于上样缓冲液中，煮沸５ｍｉｎ，在ＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎ３垂直电泳仪上
表１本实验所用ＰＣＲ引物注：Ｆ为上游引物；Ｒ为下游引物
生堡捡验匡堂苤盍至Ｑ鲣生！Ｑ月筮！！鲞筮！Ｑ拐￡！也』！尘丛鲤，坐！！坠竺！鲤！：！些！！：丛垒！Ｑ
进行十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ—Ｋ８、Ｋ９和ＫＩＯ与Ｋｌ～Ｋ７菌株紧密相关。ＰＡＧＥ）。所用凝胶为５％浓缩胶和１２％分离胶
（０．１％ＳＤＳ、１１．６％丙烯酰胺、０．４％双丙烯酰胺）。
２０ｍＡ恒流电泳８５ｍｉｎ。电泳完成后用考马斯亮蓝
染，对比肺炎克雷伯菌临床分离株与标准菌株之
间外膜蛋白条带的差异。
８．ｏｍｐＫ３５／３６基因序列分析：ＰＣＲ扩增肺炎克
雷伯菌Ｋ１和ＫＩＯ的ｏｍｐＫ３５和ｏｍｐＫ３６基因，引物
序列及相关信息如表１。ＰＣＲ扩增产物经测序后进
行基因序列分析。
结果
１．药物敏感试验：２１株黏质沙雷菌的药敏谱相
似，对亚胺培南和美罗培南中介耐药或敏感性降低，对青霉素类、头孢菌素类、头孢西丁和氨曲南耐药或中介耐药，对喹诺酮类和氨基糖甙类抗生素敏感。大肠埃希菌Ｅ１和肺炎克雷伯菌Ｋ１一Ｋ９的药敏谱相似，对亚胺培南和美罗培南敏感性降低或中介耐药，对头孢西丁耐药或中介耐药，对其余抗生素均耐药；肺炎克雷伯菌Ｋ１０对上述所有抗生素高度耐药，对亚胺培南和美罗培南的ＭＩＣ高达１２８¨ｇ／ｍｌ和２５６“ｇ／ｍｌ（表２）。
２．染体ＤＮＡ同源性分析：肺炎克雷伯菌的ＰＦＧＥ结果如图１，可见１０株肺炎克雷伯菌的酶切片段有３种模式。Ｋ１一Ｋ７菌株之间的条带数目和大小完全相同；Ｋ８和ｌ＜９菌株（分离自ＳＩＣＵ）条带相同。Ｋ１一Ｋ７菌株、Ｋ８和Ｋ９菌株及ＫＩＯ菌株３者之间有２～３个条带的差异。根据Ｔｅｎｏｖｅｒ等¨刮提出的解释标准，Ｋ１～Ｋ７为相同菌株（Ｉｎｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈａｂｌｅ），
注：１一ｌＯ分别为肺炎克雷伯菌Ｋｌ—Ｋ１０菌株；１ｌ和１２
为用于对照的不产ＫＰＣ－２的两株肺炎克雷伯菌；箭头所
指处为有差异的条带
图１肺炎克雷伯菌染体ＤＮＡ限制性酶切片段的
ＰＦＧＥ图
多次用ＰＦＧＥ对２１株黏质沙雷菌进行同源性分析，结果都因染体ＤＮＡ降解而失败，因此改用ＥＲＩＣ—ＰＣＲ分析。黏质沙雷菌的ＥＲＩＣ—ＰＣＲ结果如图２，２１株黏质沙雷菌ＥＲＩＣ—ＰＣＲ扩增产物的电泳条带基本相同且与对照菌株有明显差异，认为是同一个克隆株。
３．接合试验及质粒酶切图谱分析：所有黏质沙雷菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌菌株均接合成功。３２株接合子的药敏谱基本相同，对亚胺培南和美罗培南的ＭＩＣ为１～２斗ｇ／ｍｌ，虽处于敏感水平，但与接合前（ＭＩＣ≤０．１２５¨ｇ／ｍ１）相比敏感性明显降低；对青霉素类、头孢菌素类、氨曲南等抗生素耐药或中
表２黏质沙雷菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌及所有接合子以及黏质沙雷菌质粒消除株ＭＩＣ值（肛ｇ／ｌｌｌｌ）
生堡捡验匡堂盘盔２鲤！生！Ｑ旦筮≥！鲞筮！Ｑ翅ｇｂ边』坠！丛塑：Ｑ！塑！！！！鲤§，Ｙ丛！！，盟！：！Ｑ
介耐药，对喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素敏感。
注：１—２１分别为黏质沙雷菌Ｓ１一￥２１菌株；２２—２４为
用于对照的不产ＫＰＣ－２的３株黏质沙雷菌；２５为黏质
无机砂浆沙雷菌中的ｂｌａＫｅｃ－２编码质粒函为阴性对照；Ｍ为标准带
图２黏质沙雷菌ＥＲＩＣ—ＰＣＲ扩增产物电泳结果
黏质沙雷菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌及其接合子质粒ＤＮＡ的电泳图如图３，肺炎克雷伯菌Ｋ１一Ｉ（９质粒条带相同，Ｋ１０菌株略有不同（图３Ａ）；２１株黏质沙雷菌的质粒条带相同（图３ａ中只列出部分菌株）。３２株接合子的质粒条带相同（图３ｂ中只列出部分接合子），且与黏质沙雷菌临床菌株的质粒条带相同，均只有１个质粒，大小约６００００ｂｐ。
大肠埃希菌、部分肺炎克雷伯菌和黏质沙雷菌接合子以及部分黏质沙雷菌临床菌株的质粒ＤＮＡ的限制性酶切图如图４，ＥｅｏＲＩ、Ｈｉｎｄ１９和ＢｅｕＩ３种限制性内切酶的酶切图完全相同，认为它们是同一种质粒。
４．ＩＥＦ：图５为部分菌株的ＩＥＦ结果。黏质沙雷菌产ｐＩ６．５和６．７２种Ｂ内酰胺酶，与此前我们报道的１株黏质沙雷菌相同；肺炎克雷伯菌产ｐＩ５．４、６．７、７．３和７．９４种１３内酰胺酶；大肠埃希菌产ｐＩ６．７、７．３和９．０３种１３内酰胺酶；３种细菌的接合子均产ｐＩ６．７１种Ｂ内酰胺酶。
５．黏质沙雷菌质粒消除试验：由图４的酶切图可知黏质沙雷菌临床菌株及其接合子含有相同的质粒，而ＩＥＦ结果显示黏质沙雷菌临床菌株产ｐＩ６．５和６．７２种１３内酰胺酶，接合子只产ｐＩ６．７１种Ｂ内酰胺酶，因此考虑ｐＩ６．５的酶可能为染体所编码。我们选择３株黏质沙雷菌（ｓ５，Ｓ１０和Ｓ１５）用ＳＤＳ进行质粒消除试验，结果均获得成功。３株质粒丢失的黏质沙雷菌对表２中所列的除氨苄西林以外的所有抗生素均敏感；相同的质粒提取方法提取不到质粒ＤＮＡ；ＩＥＦ显示３株质粒消除菌株均不产１３内酰胺酶。
注：ａ图为临床菌株的质粒，１为大肠埃希菌Ｅｌ菌株；２
—１１分别为肺炎克雷伯菌Ｋｌ—Ｋ１０菌株；１２一１４分别
为黏质沙雷菌ＳＩ、Ｓ１０和￥２０菌株；Ｍ为大肠埃希菌
Ｖ５１７。ｂ图为接合子质粒，１为大肠埃希菌Ｅｌ菌株的接
合子；２—４分别为肺炎克雷伯菌Ｋｌ、Ｋ８和Ｋ１０菌株的
接合子；５—７分别为黏质沙雷菌ＳＩ、Ｓ１０和￥２０菌株的
kendeji接合子；Ｍ为大肠埃希菌Ｖ５１７
图３大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和部分黏质沙雷菌及
接合子质粒电泳图
注：１为大肠埃希菌Ｅｌ菌株的接合子；２—４分别为肺炎
克雷伯菌Ｋｌ、髓和Ｋ１０菌株的接合子；５—７分别为黏
质沙雷菌Ｓｌ、Ｓ１０和￥２０菌株的接合子；８和９为黏质沙
雷菌ｓｌ和Ｓ１０Ｉ临床菌株；质粒ＤＮＡ经ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄⅢ
和ＢｅｕＩ等限制性内切酶消化
图４大肠埃希菌、部分肺炎克雷伯菌和黏质沙雷菌接
合子及黏质沙雷菌临床菌株质粒ＤＮＡ的限制性酶切图
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