第３期庄平等：１７－Ｂ雌二醇对西伯利亚鲟卵黄蛋白原的诱导及检测２５３ 条件下静置４ｈ，再于４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上层血清一７０℃保存待用。 １．２．３西伯利亚鲟Ｖｔｇ的分离纯化
凝胶过滤层析：上样前先平衡１．５个柱体积，取卵蛋白粗提取液上柱，选取丙烯葡聚糖凝胶
ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－３００作为填料，柱子规格为１．６Ｘ７０ｃｍ，用２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣＩ缓冲液（ｐＨ８．０，含０．１ｍｏｂ／ＬＮａＣｌ）匀速洗脱，洗脱流速０．８ｍｌＶｍｉｎ。采用上海精科公司ＨＤ－９７０４型核酸蛋白检测仪在线检测（波长定于２８０ｎｍ），电脑自动记录洗脱曲线。自动分部收集器以每管２ｍＬ收集各洗脱峰，洗脱完毕合并主峰。聚丙烯凝胶电泳分析各洗脱峰，将可能含有卵黄脂磷蛋白（Ｌｖ）组分的洗脱液用ＹＥＬＡＦＤＵ—１１００型冷冻干燥机对收集液进行浓缩（一４５℃，１０Ｐａ）后备用。 离子交换层析：将样品上柱，选取阴离子交换树脂ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ作为填料自行装柱（１．６Ｘ２０ｃｍ），用分别含有０．１、０．２、０．３、０．４和０．５ｍｏＬ／ＬＮａＣｌ的Ｔｒｉｓ．ＨＣＩ缓冲液（２０ｍｍｏＬ／Ｌ，ｐＨ８．０），以２ｍＬ／ｍｉｎ的流速进行分部洗脱，于２８０ｎｍ处进行蛋白紫外检测仪在线检测。自动分部收集器以每管３ｍ
Ｌ收集各洗脱峰，洗脱完毕合并主峰。将可能是日的蛋白样品放入透析袋中，用５０ｍＭＴｒｉｓ．ＨＣＩ（含１ｍＭＰＭＳＦ，ｐＨ８．０）透析２４ｈ除盐。然后采用ＥＹＥＬＡＦＤＵ．１１００型冷冻干燥机对收集液进行浓缩（一４５℃，１０Ｐａ）。并测定其蛋白质浓度。
１．２．４聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
将浓缩的各洗脱峰分别进行变性聚丙烯酰胺电泳。分离胶浓度为１２％，浓缩胶浓度为４％，样品与上样缓冲液以４：ｌ混合，浓缩电压１００Ｖ，分离电压恒定为１８０Ｖ。待指示剂距分离胶末端０．５ｃｍ处停止电泳。电泳后的凝胶用固定液（甲醇：冰醋酸：蒸馏水＝５：１：４）浸泡２ｈ，然后于０．１％考马斯亮蓝Ｒ．２５０染２ｈ，再在脱液（甲醇：冰醋酸：蒸馏水＝１：１：８）中脱至背景清晰Ｌ８Ｊ。用ＢＩＯ—ＲＡＤ凝胶成像系统拍照保存。所分离的蛋白质的分子量采用ＢＩＯ—ＲＡＤ凝胶图像分析软件ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅＶｅｒｓｉｏｎ４．５．２进行计算。
丙烯酞胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）浓缩胶浓度为４％，
分离胶浓度为７％。样品与上样缓冲液４：１混合，每
孔上样２０ｕＬ，浓缩电压为６０Ｖ，分离电压恒定为１６０
电动
Ｖ，指示染料溟酚蓝跑出底部后１５ｒａｉｎ停止电泳，考马
斯亮蓝Ｒ－２５０染２ｈ，脱过夜。
１．２．５氨基酸组成分析
目的蛋白经浓缩后加入６ｍｏＬ／ＬＨＣｌ，充氮气，封
管；在１１０℃条件下水解２４ｈ。开管，样品抽真空干
燥，去离子水洗。水解后氨基酸样品用缓冲液稀释后
上机，用Ｂｉｏｃｈｒｏｍ２０型氨基酸自动分析仪分析。
２结果
２．１Ｅ：诱导西伯利亚鲟血清分析封盾
雌激素诱导西伯利亚鲟血清和对照组血清进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳分析（图１）。从图１中可见，诱导组鱼血清中明显多出两条蛋白条带，而在阴性对照中没有出现。
２．２Ｖ蟾的分离纯化图ｌＥ２诱导西伯利亚鲟血清ＳＤＳ・ＰＡＧＥ电泳分析Ｆｉｇ．１ＳＤＳ．ＰＡＧＥｆｏｒｔｈｅｓｅｌｒｕｍｏｆＳｉｂｅｒｉａｎ
ＳｔｕｒｇｅｏｎｗｉｍＥ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
１：诱导西伯利亚鲟幼鱼血清；２：成熟雌性西伯利亚鲟血清；３：对照组两伯利哑鲟幼鱼血清；４：标准蛋白
ｌ：１１ｌｅｓｅｒｕｍｏｆＳｉｂｅｒｉａｎＳｔｕｒｇｅｏｎｗｉｔｈＥ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ；２：Ｔｈｅ∞ｌ＇ＲｌｌｔｌｏｆｎｌａｔｕｒｅＳｉｂｅｒｉａｎＳｔｕｒｇｅｏｎ；３：Ｔｈｅ８ｅｎｌｍｏｆｊｕｖｅｎｉｌｅＳｉｂｅｒｉａｎＳｔｕｒｇｅｏｎｗｉｔｈｏｕｔＥ２ｔｒｅａｔｍｅｒｆｌ；４：Ｍａｒｋｅｒ
未诱导西伯利、亚鲟幼鱼血清和Ｅ：诱导西伯利哑鲟血清分别经ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－３００凝胶过滤层析的洗脱曲线如图２、图３所示。对比两组层析曲线发现，诱导组西伯利亚鲟血清中比对照组多出一收集峰（图３，峰Ⅱ）。收集浓缩该峰蛋白洗脱液做进一步ＤＥＡＥＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层析，如图４所示。从图４
中可见，各峰之间分离效果良好，经电泳检测发现峰Ａ有明显大分子主带出现。收集Ａ峰脱盐冷冻干
海洋渔业２０１０年
燥，于一７０℃保存待用。
蝇蛆蛋白０．６Ｏ．５
ｏ
瑙§ｏ・４
罘七０．３
餐量ｏ．２《
０．１
洗脱时间（１ｉｎ）
Ｅｌｕｔｉｏｎｔｉｌｅ
图２西伯利亚鲟对照组血清Ｓｅｐｈａｃｒｙｌｓ－３００洗脱曲线
Ｆｉｇ．２
Ａｎａｌｙｔｉｃｅｌｕｔｉｏｎ
ｃｕｒｖｅ
三维数据采集ｏｆｃｏｌｕｍｎ
圆弧齿同步带ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
ｏｎ
ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－３００ｆｏｒ
ｓｅｒｕｍｏｆＡｃｉｐｅｎｓｅｒｂａｅｒｉｉ
蜊
杂督
２．３
卵黄蛋白原的Ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥ电泳分析
将纯化所得的Ｖｔｇ进行Ｎａｔｉｖｅ—ＰＡＧＥ电泳分析，
所分离的Ｖｔｇ蛋白的分子量采用ＢＩＯ－ＲＡＤ凝胶图像桑
分析软件Ｑｕａｎｔｉｔｙ
ＯｎｅＶｅｒｓｉｏｎ
４．５．２进行计算，得出邕
其分子量为３９０ＫＤａ左右（图５）。２．４西伯利亚鲟Ｖｔｇ氨基酸组成分析
将西伯利亚鲟Ｖｔｇ的氨基酸组成与哲罗鱼（Ｈｕｃｈｏｐｅｒｒｙ／）Ｌ９］、玫瑰无须钯（Ｐｕｎｔｉｕｓｃｏｎｃｈｏｎｉｕｓ）¨０Ｉ、金鱼（Ｃａｒａｓｓｉｕｓａｕｒａｔｕｓ）¨ｕ和石斑
鱼（Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓｓｐ．）¨２Ｊ的比较结果见表ｌ。表ｌ显示，西伯利亚鲟Ｖｔｇ中谷氨酸（１２．２５％）、丙氨酸（１０．１５％）、赖氨酸（ｇ．４３％）、天冬氨酸（８．３７％）和亮氨酸（８．１ｌ％）含量较高，共计占氨基酸总含量的４７．３ｌ％，这与表１中其它鱼类十分类似。含量较少的是甲硫氨酸（１．５６％）和组氨酸（２．４２％）。与玫瑰无须鲍、金鱼类似，没有检测到半胱氨酸。
３讨论
洗脱时间（１ｉｎ）
Ｅｌｕｔｉｏｎｔｉｌｅ
图３西伯利亚鲟Ｅ：诱导组血清
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌｓ－３００洗脱曲线
Ｆｉｇ．３自动钎焊设备
Ａｎａｌｙｔｉｃｅｌｕｔｉｏｎ
ｃｕｒｖｅ
ｏｆｃｏｌｕｍｎ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｏｎＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－３００ｆｏｒｔｈｅ
ｓｅｒｕｍｏｆＡｃｉｐｅｎｓｅｒｂａｅｒｉｉｗｉｔｈＥ２ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
洗脱时间（１ｉｎ）
Ｅｌｕｔｉｏｎ
ｔｉｌｅ
图４卵黄蛋白原的ＤＥＡＥ
Ｆａｓｔ
Ｆｌｏｗ离子
交换层析洗脱曲线
Ｆｉｇ．４
Ａｎａｌｙｔｉｃｅｌｕｔｉｏｎ
ｃｕｒｖｅ
ｏｆ
ｃｏｌｕｍｎ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
ｏｎ
ＤＥＡＥＦａｓｔＦｌｏｗｆｏｒｐｅａｋ
ｌＩｐｒｏｔｅｉｎ
０
≥
ｏ
ｅ
Ｈ
譬
Ｚ
卵黄蛋白原是所有卵生动物的Ｌｖ的前提。Ｖｔｇ分子量在１７０～６００ＫＤａ之间，它共价结合有糖和磷，非共价结合有脂类，因此是一种磷脂糖蛋白¨３｜。虽然不同种类的卵黄蛋白原产生的方式不同，同源性也较差，但是所有卵生动物，包括蠕虫、海胆、鱼类、两栖类和鸟类，其卵黄蛋白原在结构和功能上还是有很多相图５诱导西伯利亚鲟血清和纯化的
似之处。卵黄蛋白原可以为正在发育着的胚胎提供氨Ｆｉｇ．５≤黑芝慧｝慧嚣罨嚣专之ａｎｄ。ｈｅ
基酸、脂肪、碳水化合物、维生素、磷、硫等营养物
ｐｉａｓｍａｏｆＡ却口一ｓ盯ｂａｅｒ／／ａｆｔｅｒ
Ｅ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
质¨４Ｉ。卵黄蛋白原只有在卵黄生成期间在成熟雌鱼Ｍ：分子量标准；１：两步层析后的Ｖｔｇ；２：凝胶过滤层析后的
中产生，雄鱼及幼鱼只有在暴露于类雌激素物质水环ＭＶｔ：ｇ；ＩＪａ３。：氨耋誉伯１：利Ｖ亚ｔｇ嚣嬲ｂｙ
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌｓ－３００鲫ｄ。ＥＡＥ
境中才会被诱导产生Ｖｔｇ。目前，已有多种硬骨鱼类ＦａｓｔＦｌｏｗ；２：ＶｔｇｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－３００；３：Ｔｈｅ
８ｅｉＭｍ
ｏｆ
Ｖｔｇ被纯化鉴定。Ｈｉｒａｍａｔｕｓ等¨列从罗非鱼（Ｈｕｃｈｏ
Ａｃｉｐｅｎｓ”６…”ｍ
Ｌ２魄姗ｍ
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
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