王良
【摘 要】我国细菌纤维素生产存在的主要问题有产量低、成本高等。本实验通过诱变筛选出一株较佳产细菌纤维素生产菌,利用玉米糖化液为碳源,对其发酵工艺进行优化研究,获得了较好效果,对于提高细菌纤维素产量,降低发酵成本均有较好的效果,也为细菌纤维素的工业化生产提供了理论依据和实践基础。 【期刊名称】《生物化工》
启动子【年(卷),期】2016(000)002
【总页数】7页(P20-25,38)
【关键词】木醋杆菌;诱变;发酵
【作 者】王良
【作者单位】黑龙江生物科技职业学院
【正文语种】中 文
【中图分类】TQ920.6
目前，细菌纤维素的生产成本较高。究其原因，一方面是传统方法需使用的培养基较昂贵，导致生产成本过高，难以产业化[1-3]；另一方面是传统方法多使用浅盘发酵，缺乏具有转化效率高、产量高、遗传性状稳定并可用于液体深层发酵的菌种[4]。本文采用传统的紫外线诱变筛选高产细菌纤维素菌株，以玉米为原料对其发酵工艺进行优化，以获得最大产量，节约生产成本，并为黑龙江省的玉米深加工提供新的途径，为今后中试或工业化生产提供实验支持，并奠定理论基础。 1.1 实验材料
1.1.1 试验菌株
木醋杆菌（Acetobacter xylinus）Mc-5，黑龙江轻工科学研究院保藏。
1.1.2 培养基
种子培养基配方：玉米糖化液2%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，氯化钠0.5%。发酵培养基配方：玉米糖化液5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，硫酸镁0.2%。
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1.1.3 试剂与仪器
试剂均为分析纯，进口或国产。
YXQ-SG46-280S手提式高压灭菌锅（上海医用核子仪器厂）；PY60s恒温振荡培养器（武汉汇诚生物科技有限公司）；GT10-1高速离心机（北京时代北利离心机有限公司）；UV2401紫外分光光度计（日本岛津公司）；WS2-134-75培养箱（上海跃进医疗器械厂）；PHB-4 pH计（上海精密仪器有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 菌种活化
将从冰箱冷冻保存的菌种转接到种子固体平板培养基上，30℃恒温培养3d，进行划线分离，然后挑取单菌落转接到斜面培养基上，30℃恒温培养24h，放置于-4℃冰箱中保存备用[5]。
1.2.2 紫外线诱变与筛选
1.2.2.1 诱变
取经过0.6u/mL青霉素预处理1.5h的菌液5mL于离心管中，4 000r/min离心，取上清液，用高渗液洗涤2次，配成高渗菌悬液，加入1.0rag/mL溶菌酶于34℃保温15.0h，离心洗涤，用高渗液悬浮，制成原生质体高渗悬浮液。采用15W紫外灯，距离30cm，照射0～120s，边搅拌边照射，力求使菌体均匀吸收紫外线光波。以上照射过程在暗室中进行，以免光修复。将经过紫外线诱变后的菌体转入到无菌试管中，并立即浸入冰水中l.0h。在低温条件下，细胞内参与对突变体修复的各种酶类活性受到抑制，使修复难以进行，有利于提高突变率[6]。采用夹层法于32℃恒温箱中培养48h，根据菌落计数，绘制原生质体紫外诱变致死率曲线[7]。根据所获得的最佳紫外诱变剂量处理高渗菌悬液，然后涂布到平板上进行培养。
1.2.2.2 筛选
1）发酵培养。从培养至对数生长期的平板上随机挑取50个单菌落接种到装有富集培养基
的试管中，在28℃培养5d后，挑取10支长膜较好的试管中的菌体用摇瓶进行复筛。将10支试管中的菌株分别接种到盛有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在28℃下培养5d，提取产物，干燥称重，保存产细菌纤维素能力较强的菌株。2）纤维素的提取及产量测定。当发酵产细菌纤维素结束时，先将发酵液在高速离心机中以3 000r/min的速度高速离心20min后倒掉上清液，取离心沉淀物用4% NaOH溶液在100℃沸水浴中加热30min去除菌体蛋白，再离心取沉淀，加入适量中性洗涤液在100℃的水浴中加热1h以除去沉淀物质中的杂糖和脂类等杂质，然后用去离子水和0.5%乙酸反复冲洗，最后80℃烘干24h，冷却至室温进行称量。3）残糖浓度的测定。残糖浓度的测定采用DNS法[8]。4）残氮浓度的测定。发酵液中残氮的测定用考马斯亮蓝结合法[9]。5）pH的测定。利用pH计测定发酵液的pH值。6）菌种筛选。经综合分析，挑选细菌纤维素产量高，发酵液残糖和残氮含量低、产酸较少的菌株。
1.2.3 连续传代实验人脸识别医疗
将紫外诱变筛选的菌株传代5次，每代分别进行发酵并检测其产细菌纤维素的量，从而确定最佳发酵出发菌株。
1.2.4 细菌纤维素的提取及产量测定
当发酵产细菌纤维素结束时，先将发酵液在高速离心机中以3 000r/min的速度高速离心20min后倒掉上清液，取离心沉淀物用4% Na0H溶液在100℃沸水浴中加热30min去除菌体蛋白，再离心取沉淀，加入适量中性洗涤液在100℃的水浴中加热1h以除去沉淀物质中的杂糖和脂类等杂质，然后用去离子水和0.5%乙酸反复冲洗，最后80℃烘干24h，冷却至室温进行称量[10]。
1.2.5 发酵工艺条件优化研究
1.2.5.1 发酵方法
发酵在1L三角瓶中进行，每个试验重复3次。
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1.2.5.2 氮源及其浓度的确定
1）取活化好的斜面菌种接入种子培养基，28℃下振荡培养14h，然后使用4%的接种量接入分别以1%酵母膏、蛋白胨、玉米浆为氮源的发酵培养基中，于30℃振荡培养5d，提取
细菌纤维素，干燥称重，比较实验结果。2）以所确定的氮源按不同的梯度浓度加入到发酵培养基中，然后以4%的接种量接入到培养基中，于30℃振荡培养5d，提取细菌纤维素，干燥称重，比较实验结果。
1.2.5.3 接种量的确定
取活化好的斜面菌种接入种子培养基，30℃振荡培养14h，然后分别以1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%和5.0%的接种量接入发酵培养基中，30℃振荡培养5d，提取细菌纤维素，干燥称重，比较实验结果。
1.2.5.4 培养时间的确定
取活化好的斜面菌种接入种子培养基，30℃振荡培养14h，然后以4%的接种量接入发酵培养基中，于30℃振荡培养1、2、3、4、5、6d和7d，提取细菌纤维素，干燥称重，比较实验结果。
立体剪裁1.2.5.5 培养使用有机酸的确定
取活化好的斜面菌种接入种子培养基，30℃下振荡培养14h，然后以4%的接种量接入添加了0.1%的柠檬酸、醋酸、乳酸的发酵培养基中，于30℃恒温振荡培养5d，提取细菌纤维素，干燥称重，比较实验结果。
1.2.5.6 单因素实验分析
1）初始pH对纤维素产量的影响
取活化好的斜面菌种接入种子培养基，30℃下恒温振荡培养14h，然后以4%的接种量接入pH分别 为2.5、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5的发酵培养基中，于30℃振荡培养5d，提取细菌纤维素，干燥称重，比较实验结果。
2）培养温度对纤维素产量的影响
取活化好的斜面菌种接入种子培养基，30℃下振荡培养14h，然后以4%的接种量接种发酵培养基培养，分别在24、27、30、33、36℃和39℃的温度下振荡培养5d，提取细菌纤维素，干燥称重，比较实验结果。
3）通风量对细菌纤维素产量的影响
取活化好的斜面菌种接入种子培养基，30℃下振荡培养14h，然后以4%的接种量接种发酵培养基培养，分别在转速50、100、150、200、250r/min和300r/min下振荡培养5d，提取细菌纤维素，干燥称重，比较实验结果。
4）有机酸对细菌纤维素产量的影响
取活化好的斜面菌种接入种子培养基，30℃下振荡培养14h，然后以4%的接种量接入添加实验确定的不同量的有机酸，比较实验结果。
5）乳酸盐对纤维素产量的影响
取活化好的斜面菌种接入种子培养基，30℃下振荡培养14h，然后以4%的接种量接入添加了0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%和 0.30%的乳酸盐的发酵培养基中，于30℃振荡培养5d，提取细菌纤维素，干燥称重，比较实验结果。
2.1 紫外诱变筛选结果
2.1.1 紫外致死曲线
采用15W紫外灯，距离30cm，照射0、20、40、60、80、100s和120s，边搅拌边照射，力求使菌体均匀吸收紫外线光波。以上照射过程在暗室中进行，以免光修复。将经过紫外线诱变后的菌体转入到无菌试管并立即浸入冰水中1h。在低温条件下，细胞内参与对突变体修复的各种酶类活性受到抑制，使修复难以进行，有利于提高突变率。采用夹层法于32℃恒温箱中培养48h，根据菌落计数，绘制原生质体紫外诱变致死率曲线，所得曲线如图1所示。
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