(重庆文理学院生命科学与技术学院，重庆 永川 402160)
摘要：免疫学检测技术广泛应用于植物病毒测定，是当今主要的病毒检测方法之一。该文针对免疫学方面讲述了现代主要应用的植物病毒免疫检测的方法。
关键词：植物病毒；免疫；免疫检测
Immune Detection of Plant virus
Xing Yang-wu
（School College of Life Science and Technology，Chongqing University of Arts and Sciences，Yongchuan，Chongqing 402160，China）
Abstract: Immunological detection technology is widely used in plant virus measured，and Is one of the major virus detection today.This paper describes for the immunological aspects of the main applications of modern plant virus immune detection.
Key words:plant virus; immune; immune detection
植物病毒危害日益严重，不仅对植物造成伤害，还给种植业带来重大的损失。因此植物病毒防治越来越受到广泛关注，其病毒检测方法不断提高。随着检验检疫有害生物范围的扩大，检测精确性、灵敏度、检验时间及简化操作程序要求的日益提高，传统的形态学、细胞学等方法已经远远不能满足检测的需要[1]。植物病毒的免疫学检测是最普遍广泛应用的检测方法之一，这方面的研究也在不断的深入。下文讲述近年来主要应用的植物病毒免疫检测方法。
南瓜加工1 酶联免疫吸附测定
酶联免疫吸附测定(ELISA)是在植物病毒病诊断上最广泛使用的一种免疫学方法。它不仅具有免疫荧光法和放射免疫法的反应灵敏、特异性强的优点，而且克服了常规血清学方法受病毒浓度、粒体形态和抗血清用量等限制的缺点[2]。其原理是把抗原抗体的免疫反应与酶的高效催化作用相结合，通过化学方法将酶与抗体结合，形成酶标抗体。在遇到相应底物时，酶催化无底物产生化学反应，生成有化合物，其强度与病毒浓度成正比，用此方
法也可测定出病毒的浓度，既保持了酶催化反应的敏感性，又保持了抗原抗体反应的特异性，因而极大的提高了灵敏度[3]。
ELISA反应有多种方法，如间接法、双抗体法、竞争法、双夹心法和酶一抗酶抗体法等等，但实验的基本过程都相似。E.LISA反应有很高的灵敏度，用它检测菜豆黄斑花叶病毒(BYMV) ，所使用提纯的病毒抗原浓度仅需5ng/mL。但其灵敏度与核酸杂交技术相比还稍差[4] .ELISA反应快速便利，很适合于大规模田间样本的常规病毒检测，也广泛用于脱毒植物、无性繁殖的苗木以及种子上的病毒检测[5]。
2 免疫荧光技术[6]
免疫荧光技术(Immunofluorescene简称IF)是以抗体为基础的在病害检疫中具有重要应用价值的检测手段，现已成功应用于植物组织、种子及土壤中细菌及真菌的检测[7]。免疫荧光技术具有间接和直接免疫荧光法，其中间接免疫荧光法在实践中用途较广，一抗与结合有荧光素的二抗结合，所发出的荧光可由免疫荧光显微进行检测，如利用免疫光技术可在显微镜下检测出结合有荧光素抗体的细菌阳性细胞，免疫荧光技术检测的灵敏度一般约
为103~105cfu/mL，不仅对每个荧光细胞可以记数，而且可以观察有关细胞的形态特征[8]。虽然免疫荧光技术灵敏度高，但在实际使用中存在一定的缺陷，如需要昂贵的仪器，操作费时，并且有时受植物和土壤的自身荧光干扰，特别是在抗原量低时，自发荧光强于特异性荧光，致使观察困难，干扰了这项技术的广泛应用[9]。
3 斑点免疫法
斑点免疫法(Dot Immunobinding Assay简称DIA)，它是通过酶标记抗体与吸收附于硝酸纤维素膜(简称NC)、尼龙膜或其他支持物上的抗原发生特异性结合，经加底物溶液后在NC膜上形成有斑点的免疫学方法[10]。目前已被应用于植物病毒、MLO的检测之中[7]。斑点免疫法在对马铃薯卷叶病毒、马铃薯X病毒、烟草花叶病毒、烟草环斑病毒、烟草脉斑驳病毒、番茄花叶病毒、番茄环斑病毒、柑桔速衰病毒、花生条纹病毒、水稻草状矮化等植物组织、种子中的病毒以及花生丛枝病、葡萄黄化病等众多MLO病害的检测中也取得了较好的效果[11]。DIA可以分为多种，较常用的有直接法、间接法、双抗体夹心法。斑点免疫法操作简便、快速、能够长期保存，在灵敏度方面也高于DASM-ELISA。斑点免疫技术是一项十分有用的血清学技术，它的一个重要用途是组织免疫印迹，通常可以将组织材料(如
切割开的种子)直接与硝酸纤维素膜接触，抗原从组织中释放，并结合于膜上，通过直接法检验或使用辣根过氧化物酶(或碱性磷酸酶)标记间接检测结合于膜上的抗原。由于斑点免疫检测技术具有与电镜观察法同样高的灵敏度，且操作容易、简便，试验本身血清用量少，且可重复利用，一次性检测的样品量大，因此是一种适合检疫需要的快速诊断检测方法[12]。
4 免疫电镜技术
免疫电镜技术具有与ELISA相同的灵敏度，但比ELISA更为直观、准确、快速，对于某些难于鉴定的木本植物病毒也可检测。免疫电镜技术的电镜制片方法有多种，常用的有3种：诱捕法、修饰法和诱捕修饰法。以后又对免疫电镜技术进行了改进，灵敏度进一步提高，出现了A-蛋白免疫电镜法、羊捕兔诱捕双修饰法以及胶体金免疫电镜。胶体金免疫电镜与一般免疫电镜相比，由于胶体金具有高电子密度和其表面能结合大分子的特性，能增加免疫负染，从而提高了分辨率，而且胶体金的存在起定位作用，尤其应用在病组织的超薄切片上，其在电镜下很容易观察到病毒粒体在组织中的存在形式，是病毒细胞化学研究中的一种有效手段[11]。
免疫电镜技术可直接检测感染病毒的组织抽提液(包括显症、未显症、脱毒苗)，这已应用于TMV、PVY、PVX、Potatomop-top virus、Tobacco ring-spot virus、花椰菜花叶病毒、悬钩子花叶病毒、水稻黑条矮缩病毒、大麦黄矮病毒、柑桔速衰病毒、李豆病毒以及番茄环斑等病毒的检测之中，并取得了良好的效果。除了病毒定性外，免疫电镜技术还可以用在植物粗汁液中病毒粒体的定量分析[13]。此外，免疫电镜技术克服了以往检测MLO只能用超薄切片进行电镜观察的缺点，现已能用诱捕法诱捕MLO。
5 免疫染标记技术
胶体金染技术是利用金离子还原后的胶体金与抗体(或A-蛋白)结合形成稳定的抗体(或蛋白)——胶体金复合物，通过抗原的特异性结合，金颗粒附于同源病毒粒体的周围，从而得到检测病毒的一种免疫技术[14]。以后，又对胶体金技术进行了改进，产生了金/银免疫法染法、斑点免疫金染以及斑点金/银染法，并在植物病毒、细菌等的检测上得到了广泛的应用[15]。如利用A蛋白—胶体金复合物标记齿兰斑病毒(ORV)、大豆花叶病毒(SMA)、黄瓜花叶病(CMV)、TMV，用免疫金/银染法检测烟草环斑病毒(TrSV)，均取得了很好的效果。免疫胶体金技术不仅可检测和鉴定出植物病毒，还可以确定植物病毒在感
染细胞中的复制部位以及病毒基因产物在细胞中的合成部分，现已成功地用胶体金标记了马铃薯黄矮病毒(Potato yellow dwarf virus，PY-DV)的结构蛋白以及一些复制酸组分、转移蛋白等非结构蛋白。免疫金/银染技术是在免疫胶体金染的基础上在金颗粒周围再吸附上许多银离子，通过物理显影方法将银离子还原成重金属银而呈黑褐，从而使可见度大增强。该技术克服免疫胶体金技术不能以光学显微镜下观察的缺点，成功地应用于细菌的检测和组织免疫定位。免疫金染技术和免疫金/银染技术具有省时、灵敏、稳定、价廉的优点。缺点是胶体金标记不易与小分子物质形成稳定复合物，并对盐类极其敏感，此外，胶体金标记的组织切片，微细结构对比度不是太好，细胞膜也不能清晰可辨，对于球型病毒，如果分散在细胞中就不易辨认。不过，随着单克隆抗体、cDNA探针与免疫胶体金等染技术的结合使用，免疫染标记技术的灵敏度将会进一步提高，相信不远的将来它将成为检测方面的一种非常有用的工具。
6 快速免疫滤纸测定 (RIPA)
此方法原理是用特异性抗体球蛋白IgG孵育红白两种乳胶颗粒制备成致敏乳胶，同时用封闭剂封闭致敏乳胶上未被占据的位点，将上述乳胶粒子以红下白上的相对部位分别固定在
同一滤纸条上，测定时，当滤纸条侵入待测样品液中时，如果样品中含有待测病毒粒子，由于毛细管作用，它将与一部分红致敏乳胶结合，结合产物会同其他尚未结合的红致敏乳胶及病毒粒子一起向上迁移，当迁移到固定有白致敏乳胶部位时它们就会被吸附起来，该部位显示红。反之，如果没有待测病毒粒子，则不会产生吸附现象，该部位不显现红[16]。在兰花病毒检测中，采用致敏抗体(A蛋白)代替常规抗血清所形成的微量凝集法，其灵敏度有很大的提高[17]背板制作
7 免疫PCR
新近发展起来的免疫PCR是将抗原抗体反应的高特异性与PCR的高录敏度有机结合的检测技术与酶标检测技术相比，免疫PCR是用DNA片段取代酶来标记抗体，然后用PCR扩增DNA片段从而放大抗原抗体反应，大大提高了检测灵敏度[18]。Sharman[19]建立一种复合免疫PCR，可同时检测香蕉和车前草粗提取汁液中的香蕉苞叶花叶病毒，黄瓜花叶病毒和香蕉束顶病毒。
8 吊车梁安装电印迹免疫分析(EBLA)
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电印迹免疫分析方法首先用SDS-PAGE分离病毒CP，把蛋白带转移到膜上，再进行抗原杭体反应，根据CP分子量和吸附特异性抗血清的特殊带来判断该病毒的存在与否。
EBLA和ELISA、DIBA相比具有明显的优点，通过电泳将植物病毒的CP和植物组织中的其它蛋白分离开来，排除了杂蛋白的干扰，可检测低浓度的植物病毒。此方法不适于大量样品的检测。
9 伏安酶联免疫分析法
伏安酶联免疫分析是将酶催化、免疫技术和伏安法检测相结合的一种免疫分析方法。焦奎等[20]已研究10个伏安酶联免疫分析新体系，灵敏度均高于ELISA。伏安酶联免疫分析法具备了伏安法的高灵敏度和高准确性，又具备免疫反应的特异性，仪器设备简单，操作方便。但此方法不适宜于大量样品的分析。
10 高压灌注机免疫毛细管区带电泳(I-CZE)
毛细管区带电泳是在装有一种电解液的空毛细管两端加一个外加电压。在外加电压作用下，通过电泳迁移和电渗流的作用，样品中的不同组分由于迁移率的不同而分开。I-CZE
将血清学反应专化性和毛细管区带电泳灵敏、快速、可自动检测的特点结合起来，实时检测抗原-抗体复合体Eun[21]等应用I-CZE检测到10fg建兰花叶病毒和齿兰环班病毒的提纯病毒。I-CZE灵敏度高，且可快速分析多个样品，因而在无病毒苗木检测、抗病品种选育、植物检疫、种质筛选等方面可发挥巨大作用，有广阔的应用前景。
展望
随着生物技术的发展和应用，免疫学检测也不断得到提高和应用，从而对植物保护和疾病的防治起到重要作用。目前植物病毒的免疫检测还有诸多不完善不成熟的方面，许多技术仍需要改善，但是，我们相信这些技术一定更加广泛的服务于人类。
参考文献：
[1] 李春喜,王 新,侯秋石,等.几种新方法在植物检疫中的应用[J].山东林业科技,2006,4:62.
[2] 朱延书,康 宁.生物技术在植物检疫检测中的应用[J].江苏林业科技,2003,30(3):42-44.
[3] 金 羽,文景芝.植物病毒检测方法研究进展[J].龙江农业科学,2005,(3):37-40.
合金钢密度[4] Herrbach E,Lemaire O, Ziegler V et al. Ann Appl Biol. 1991,118:126-130.
[5] 施曼玲,周雪平.植物病毒病的诊断技术[J].微生物学通报,2000,27 (2):149-151.
[6] 邵碧英.植物病毒分子检测方法概述[J].植物免疫,2002,16(6):377-378.
[7] 田国忠.植物类病原体的检测和鉴定研究新动态[J].植物检疫,1992,6(增刊):70-72.
[8] 窦坦德,沈崇尧.植物病原真菌监测技术研究进展[J].植物检疫,2000,14(1):31-33.
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