1前言
酵素食品是指新鲜果蔬、谷物、菌菇或其它食用植物等为原料，经微生物发酵形成的，富含维生素、酶、多酚类化合物等多种生物活性物质的产品[1]。其在维持机体代谢，促消化、修复组织，抗氧化、减肥，净化血等方面具有不可代替的功效[2-4]。 酵素生产主要是自然发酵过程，在其发酵过程中会产生多种酶类、短链脂肪酸、醇、酯等代谢产物。
自然发酵过程中微生物主要来源于原料本身和加工环境，其中部分微生物会快速生长并成为优势菌，例如乳杆菌、等细菌和毕赤酵母、少见的伊萨酵母和酿酒酵母等。2试验材料与方法 2.1材料
复合水果酵素原液：发酵3个月，还原糖含量620g/L ，
pH3.25，硫酸铵、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、二水氯化钙、氯化钠、酵母膏、酵母粉、蛋白胨、葡萄糖；PDA 培养基、YEPD 培养基、碳源基础培养基、氮源基础培养基、无维生素培养基。2.2实验方法2.2.1工艺流程果肉→破碎→调配混合→发酵→成品→酵母培养→酵母分
离纯化。
2.2.2酵母菌的分离纯化用梯度稀释法，将样品涂布于PDA 培养基上进行分离纯化，
纯化后转接于斜面保存待用。
2.2.3形态特征鉴定
菌落形态观察：将纯化好的单菌落接种于PDA 固体培养基
和PDA 液体培养基，于28℃恒温培养72h ，记录菌落大小、形状、颜、质地是否有凹凸。
显微观察：挑取少许单菌落于载玻片上，用灭菌生理盐水稀释，加盖玻片，于显微镜下观察记录细胞形态、菌体大小、形状、繁殖方式。
2.2.4生理生化特征鉴定
依据《酵母菌的特征及鉴定手册》和《微生物学实验手册》进
行：糖发酵鉴定、碳源同化实验、氮源同化实验、无维生素培养基上生长实验、耐高渗透压的测试、产生类淀粉化合物测定等试验。2.2.5耐受性实验2.2.5.1
生物量-吸光度标准曲线的绘制
将纯化好的单菌落接种于YEPD 液体培养基，于28℃恒温培养1d ，制成107CFU/mL 的菌悬液。取1mL 活化好的菌液，接种于起始葡萄糖浓度为100g/L 的YEPD 液体培养基，于28℃下恒温培养2d 。
分别取5、10、15、20、25、30、35mL ，于50mL 的离心管中，
5000r/min 离心10min ，倾去上清液，将得到的2组菌体沉淀中的一组烘干、称重，另一组用去离子水定容到50mL 容量瓶中，测定D600，绘制生物质干重-吸光度的标准曲线。2.2.5.2
高糖耐受性实验
按3%的接种量，分别接种于起始葡萄糖浓度为100、200、
300、400、500g/L 的YEPD 液体培养基，pH5.0，于28℃下恒温培养5d ，OD600条件下每12h 测定一次，重复3次。2.2.5.3低pH 耐受性实验配置pH 为1、2、3、4、5、6的YEPD 液体培养基，按3%的接种
气囊减震
量接种，于28℃下恒温培养8d ，每24h 取一次样，测定OD600。
2.2.5.4
酒精耐受性实验
配置乙醇浓度为0、6%、9%、12%、15%、18%的YEPD 液体培
养基，按3%的接种量接种，于28℃下恒温培养8d ，每24h 取一次
支持基金：吉林农业科技学院大学生科技创新项目，编号【2019118】作者简介：
刘艳霞（1976-），博士，主要从事农畜特产品加工方向研究。
天然酵素酵母菌分离及理化特性鉴定
彭禹铭
刘巳齐李婧婧纪可欣李
汽车膨胀水箱岑
刘艳霞*
（吉林农业科技学院吉林132101）
摘要：从复合水果酵素中分离酵母菌，通过形态学特征，生理生化指标进行鉴定，并对其生长特性进
行研究，结果表明：分离出的A1、A2、A3为水果酵素中的优势酵母，其具有耐高糖，耐低pH 、耐高渗、耐一定酒精浓度特性，其可在初始糖量400g/L 以下，pH 为2以上，酒精浓度12%以下的环境中生长。关键词：酵素；酵母；分离；生理生化特性；
Isolation of natural enzyme yeast and identification of its physical and chemical properties
Peng Yuming ，Liu Siqi ，Li Jingjing ，Ji Kexin ，Li Cen ，Liu Yanxia*
Jilin Agricultural Science and Technology College ，Jilin 132101
Abstract ：Yeasts were isolated from complex fruit enzymes ，identified by morphological characteristics ，physiological and biochemical indicators ，and their growth characteristics were studied.The results showed that the isolated A1，A2，and A3are the dominant yeasts in fruit enzymes.It has the characteristics of high sugar resistance ，low pH resistance ，hypertonicity resistance ，and certain alcohol concentration resistance.It can grow in an environment where the initial sugar content is below 400g/L ，the pH is above 2and the alcohol concentration is below 12%.Keywords ：Enzyme ；Yeast ；Isolation ；Physiological and biochemical characteristics
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10.16627/jki22-1215/s.2021.01.036
样，测定OD600。
3结果与分析
3.1分离纯化、形态及培养特征观察筛选具有典型酵母菌落特征的菌落3株供试菌在固体、液体
培养基上的菌落形态见表3-1。
3.2菌株鉴定结果菌株生理生化特征见表3-2，初步判断三株菌株属于接合酵 母属。
3.3耐受性考察（选取A1菌株进行耐受性实验）3.3.1生物量-吸光度标准曲线
菌悬液稀释成0.1g/L ，0.15g/L ，0.2g/L ，0.25g/L ，0.3g/L ，0.35g/L
的浓度，在波长600nm 处测吸光度，绘制出生物量—吸光度标准曲线如下：
3.3.2高糖耐受性考察
每隔12h ，吸取一次菌悬液，在600nm 处测其吸光度，根据标
准曲线得出其每个时间段菌悬液的浓度。实验结果见图3-2。
由图3-2可知，在初始葡萄糖含量100~500g/L 时，随着初始葡萄糖含量的增加，菌株生长延缓期增长，当初始糖浓度为600g/L 时，菌株延缓期84h ，且生长极其缓慢。3.3.3低pH 耐受性考察
每隔12h ，吸一次菌悬液，600nm 处测吸光度，结果见图3-3。
由图3-3可知，当初始pH 为1和2时，菌株不生长，当初始
pH 为3-6时，菌株的延缓期逐渐缩短。3.3.4酒精耐受性考察
每隔12h 取一次菌悬液，在600nm 处测其吸光度，结果见图
3-4。
由图3-4可知，初始乙醇浓度为15%和18%时，菌株不生长，而在0%~12%区间时，菌株的延缓期逐渐延长。
4结论
从发酵3个月的复合水果酵素原液中分离出A1、A2、A3等三株菌株，均被鉴定为接合酵母，该菌种在
初始葡萄糖含量100~
400g/L 时，均可生长，随着初始葡萄糖含量增加，菌种的延缓期增长。在初始pH 为3~6时，随着初始pH 的增加，菌株生长的延缓
期变短。在初始乙醇浓度为0%~12%时，随着初始乙醇浓度的增加，菌株生长的延缓期增长。
参考文献
[1]中国生物发酵产业协会.T/CBFIA
08001-2016，酵素产品分类导则[S].北京：中
国标准出版社，2016.[2]毛建卫，吴元锋，方晟.微生物酵素研究进展[J].发酵科技通讯，2010，39（3）：42-44.
[3]蒋增良.天然微生物酵素发酵机理、代谢过程及生物活性研究[D].宁波：浙江理工大学，2012：1-6.
[4]蒋增良，毛建卫，黄俊，等.蓝莓酵素在天然发酵过程中抗氧化性能的变化[J].食品工业科技，2013，34（2）：194-197.
[5][英]巴尼特（Barnett ，J.A.）著，胡瑞卿
译.《酵母菌的特征及鉴定手册》[M].青岛
海洋大学出版社.2015.
[6]
刘雅婷，王建斌.《微生物学实验手册》[M].中国农业出版社，2013.
图3-2A1在不同起始葡萄糖浓度下菌种生长曲线
葡萄糖浓度：1-100g/L ，2-200g/L ，3-300g/L ，4-400g/L ，5-500g/L ，6-600g/L
表3-1
菌落形态及特征
细胞大小长轴长4.4~6.1微米；短轴长3.0~5.5微米长轴长4.1~6.7微米；短轴长3.8~5.6微米长轴长5.2~7.7微米；短轴长4.5~5.4微米A1
A2
A3组装打火机
菌落
形态光滑，圆形，不透明，边缘整齐光滑，圆形，不透明，边缘整齐光滑，圆形，不透明，边缘整齐
业务激活
菌落颜白白白凹凸微凸微凸微凸质地易挑取，粘稠易挑取，粘稠易挑取，粘稠繁殖
方式芽殖
（单边）
芽殖
（双边）
芽殖发票导出
（多边，
单边）
细胞形态椭圆棒状椭圆菌株A1
A2A3
产生类淀粉化合物
pdb培养基的测定---
因
素
碳源同化
+++
氮源同化
---
无维生素培基上的生长
+++
注：+：阳性-：阴性
图3-4A1在不同起始乙醇浓度下菌种生长曲线初始乙醇浓度：1-0；2-6%；3-9%；4-12%；5-15%；6-18%
图3-1
生物量—吸光度标准曲线
表3-2生理生化试验结果表
图3-3A1在不同起始pH 下菌种生长曲线
1：pH=1，2：pH=2，3：pH=3，4：pH=4，5：pH=5，6：pH=6
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