二、问答题
答：1、病毒基因组的特点：
①种类单一；②单倍体基因组：每个基因组在病毒中只出现一次；③形式多样；④大小不一；⑤基因重叠；⑥动物/细菌病毒与真核/原核基因相似：内含子；⑦具有不规则的结构基因；⑧基因编码区无间隔：通过宿主及病毒本身酶切；⑨无帽状结构；⑩结构基因没有翻译起始序列。
智能断句2、原核基因组的特点：
①为一条环状双链DNA；②只有一个复制起点；③具有操纵子结构；④绝大部分为单拷贝；⑤可表达基因约50%，大于真核生物小于病毒；⑥基因一般是连续的，无内含子；⑦重复序列很少。
3、真核基因组的特点：
①真核生物基因组远大于原核生物基因组，结构复杂，基因数庞大，具有多个复制起点；②基因组DNA与蛋白质结合成染体，储存于细胞核内；③真核基因为单顺反子，而细菌和病毒的结构基因多为多顺反子；④基因组中非编码区多于编码区；⑤真核基因多为不连续的断裂基因，由外显子和内含子镶嵌而 成；⑥存在大量的重复序列；⑦功能相关的基因构成各种基因家族；⑧存在可移动的遗传因素；⑨体细胞为双倍体，而精子和卵子为单倍体。
答：1、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I。
2、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。
带写字板的椅子3、CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。 4、协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相制约。
（三）、真核生物转录水平的调控机制？
答：真核生物在转录水平的调控主要是通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用来完成的，主要是反式作用因子结合顺式作用元件后影响转录起始复合物
的形成过程。
1、转录起始复合物的形成：真核生物RNA聚合酶识别的是由通用转录因子与DNA形成的蛋白质-DNA复合物，只有当一个或多个转录因子结合到DNA上，形成有功能的启动子，才能被RNA聚合酶所识别并结合。
转录起始复合物的形成过程为：TFⅡD结合TATA盒；RNA聚合酶识别并结合TFⅡD-DNA复合物形成一个闭合的复合物；其他转录因子与RNA聚合酶结合形成一个开放复合物。
在这个过程中，反式作用因子的作用是：促进或抑制TFⅡD与TATA盒结合；促进或抑制RNA聚合酶与TFⅡD-DNA复合物的结合；促进或抑制转录起始复合物的形成。
2、反式作用因子：一般具有三个功能域（DNA识别结合域、转录活性域和结合其他蛋白结合域）；能识别并结合上游调控区中的顺式作用元件；对基因的表达有正性或负性调控作用。镀锌钢管连接方式
3、转录起始的调控：
⑴反式作用因子的活性调节：①表达式调节——反式作用因子合成出来就具有活性；②共价修饰——磷酸化和去磷酸化，糖基化；③配体结合——许多激素受体是反式作用因子；④蛋白质与蛋白质相互作用——蛋白质与蛋白质复合物的解离与形成。
⑵反式作用因子与顺式作用元件的结合：反式作用因子被激活后，即可识别并结合上游启动子元件和增强子中的保守性序列，对基因转录起调节作用。
⑶反式作用因子的作用方式——成环、扭曲、滑动、Oozing。
⑷反式作用因子的组合式调控作用：每一种反式作用因子结合顺式作用元件后虽然可以发挥促进或抑制作用，但反式作用因子对基因调控不是由单一因子完成的而是几种因子组合发挥特定的作用。
（四）、真核生物转录后水平的调控机制？
（1）、5，端加帽和3，端多聚腺苷酸化的调控意义：5，端加帽和3，端多聚腺苷酸化是保持mRNA稳定的一个重要因素，它至少保证mRNA在转录过程中不被降解。
（2）、mRNA选择性剪接对基因表达调控的作用
（3）、mRNA运输的控制
（五）、受体的特点？
1、高度专一性；2、高度亲和性；3、可逆性；4、可饱和性；5、特定的作用模式
（六）、表皮生长因子介导的信号传导途径？
表皮生长因子受体是一个典型的蛋白酪氨酸激酶受体，这个信号转导途径的主要步骤是：
1、受体二聚化的形成及其磷酸化：表皮生长因子与受体的结合使受体发生二聚化，从而改变受体构象，使蛋白酪氨酸激酶活性增强，受体自身的几个蛋白酪氨酸残基在激酶的作用下发生磷酸化。
2、募集接头蛋白Grb2：表皮生长因子受体自身被磷酸化后，不仅其激酶活性增强，而且其构象发生变化，从而适合与含SH2结构域的蛋白分子相结合。Grb2是作为接头蛋白结 合到受体上。
3、调控分子SOS的活化：SOS含有可与SH3结构域相结合的富含脯氨酸基序，当Grb2结合到磷酸化的表皮生长因子受体后，它的两个SH3结构域即可结合SOS，使之活化。
4、低分子量G蛋白Ras的活化：SOS可促进Ras释放GDP，结合GTP的反应，使Ras激活。活化的Ra
s作用其下游分子Raf，使之活化。Raf是MAPK级联反应的第一个分子，由此启动了MAPK的三级激活过程。
5、MAPK的级联激活：Raf是一种MAPKKK，它作用于MEK，使之磷酸化而激活，活化的MEK在作用于MAPK家族的ERK1，使之磷酸化激活由此完成了三级激活。
6、转录因子的磷酸化及转录调控作用：活化的ERK可以转至细胞核内，使某些转录调控因子发生磷酸化，从而影响基因的转录。
（七）、cAMP信号转导途径？
答：1、组成：胞外信息分子（主要是胰高血糖素、肾上腺素和促肾上腺皮质激素），受体，G蛋白，AC，cAMP , PKA。
2、途径：
信号分子与受体结合，引起受体构象变化
受体活化G蛋白
活化后的G蛋白激活腺苷酸环化酶（AC）
AC催化ATP生成cAMP
cAMP活化PKA，PKA使目标蛋白磷酸化，调节代谢酶的活性或调节基因的表达
（八）、IP3-Ca2+信号途径：
信号分子与受体结合，引起受体构象变化
受体活化G蛋白
活化后的G蛋白激活PLC
PLC水解PIP2生成IP3 和DG
IP3 使钙通道打开，细胞内Ca2+升高
Ca2+与CaM结合，激活Ca2+-CaM依赖的蛋白激酶
Ca2+-CaM依赖的蛋白激酶使目标蛋白磷酸化。
（九）、分子克隆中常用的工具酶及良好载体的条件？
（1）、常用的工具酶
1、限制性核酸内切酶：是细菌产生的一类能识别和切割双链DNA分子内特定的碱基顺序的核酸水解酶。
2、DNA连接酶：将两段DNA分子拼接起来的酶。
3、DNA聚合酶：催化单核苷酸链延伸。
4、逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶，这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，产物DNA又称互补DNA。
5、末端脱氧核糖核酸转移酶：将脱氧核糖核酸加到DNA的3末端。
6、碱性磷酸酶：催化去除DNA、RNA等的5磷酸基团。
7、依赖DNA的RNA聚合酶：识别特异性启动子，RNA转录。
（2）、良好载体的条件
1、必须有自身的复制子；2、载体分子上必须有限制性核酸内切酶的酶切位点，即多克隆位点，以供
外源DNA插入；3、载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性重组子和阴性重组子；4、载体分子必须有足够的容量；5、可通过特定的方法导入细胞；6、对于表达载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、增强子、加尾信号等DNA调控元件。
流化床（十）、蓝-白筛选的原理？
答：某些
质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一段含多种单一限制酶位点的DNA序列。这些位点上如果没有克隆外源性DNA片段，在质粒被导入lac-的大肠杆菌后，质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，与大肠杆菌的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和诱导剂IPTG后，出现蓝的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白。由于这种颜标志，重组克隆和非重组克隆的区分一目了然。
（十一）SANGER双脱氧链终止法的原理？
答：DNA链中核苷酸以3’,5’-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是 2’-脱氧核苷三磷酸。2’,3’ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基。在DNA聚合酶作用下通过三磷
酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3’羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争，产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离。在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置。94crw
（十二）、核酸分子杂交的原理？
答：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及在复性过程中个分子间键的形成和断裂。杂交的双方是待测核酸和已知序列。
（十三）、影响杂交的因素？
1、核酸分子的浓度和长度：核酸浓度越大，复性速度越快。探针长度应控制在50-300个碱基对为好。
2、温度：温度过高不利于复性，而温度过低，少数碱基配对形成的局部双链不易解离，适宜的温度是较TM值低25度。
3、离子强度：在低离子强度下，核酸杂交非常缓慢，随着离子强度的增加，杂交反应率增加。高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，所以进行序列不完全同源的核酸分子杂交时必须维持杂交反应液中的盐浓度和洗膜液中的盐浓度。
4、杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的TM值。它有以下优点：在低温下探针更稳定；能更好地保留非共价结合的核酸。
5、核酸分子的复杂性：是指存在于反应体系中的不同顺序的总长度。两个不同基因组DNA变性后的相对杂交速率取决于样品浓度绝对一致时的相对复杂性（即DNA中的碱基数）。
6、非特异==反应
：在杂交前应对非特异==反应位点进行封闭，以减少其对探针的非特异性吸附作用。
（十四）、探针的种类和优缺点？
答：1、cDNA探针：通过逆转录获得cDNA后，将其克隆于适当的克隆载体，通过扩增重组质粒而使cDNA得到大量的扩增。提取质粒后分离纯化作为探针使用。它是目前应用最为广泛的一种探针。
2、基因组探针：从基因组文库里筛选得到一个特定的基因或基因片段的克隆后，大量扩增、纯化，切取插入片段，分离纯化为探针。
3、寡核苷酸探针：根据已知的核酸顺序，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段作为探针。
4、RNA探针：采用基因克隆和体外转录的方法可以得到RNA或反义RNA作为探针。
（十五）、探针的标记法？背心袋生产设备
1、缺口平移法：此法是利用适当浓度的DNase Ⅰ在DNA双链上随机切割单链，造成单链切口。切口处产生一个5末端和3末端，3末端就可以作为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的催化下，以互补的DNA单链为摸板，依次将dNTP连接到切口的3末端的羟基上，合成新的DNA单链；同时DNA聚合酶Ⅰ的5→3的核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除，新合成链不断延伸，从而使原DNA分子上的部分核苷酸残基被标记的核苷酸所取代。
2、随机引物法：随机引物是人工合成的长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物。对于任何一个用作探针的DNA片段，随机引物混合物中都会有一些六核苷酸片段可以与之结合，起到DNA合成引物的作用。将这些引物与变性的DNA单链结合后，以4种dNTP（其中一种是标记物标记的dNTP）为底物，合成与探针DNA互补的切带有标记物的DNA探针。
3、PCR标记法：在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记的dNTP， 这样标记的dNTP就在PCR反应的同时掺入到新合成的DNA链上。
4、末端标记法：只是将DNA片段的一端进行标记。
（十六）、PCR的基本原理？
答：PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸３个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。DNA模板变性：模板双链DNA®单链DNA，94℃。退火：引物＋单链DNA®杂交链，引物的Tm值。引物的延伸：温度
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