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荧光原位杂交（FISH）检测技术共识

荧光原位杂交（FISH）检测是临床病理检测中⼴泛运⽤的⼀种分⼦细胞遗传学诊断技术，在标本处理、检测步骤、结果判读、质量控制等各个环节实现检测的规范化和标准化，对提⾼检测的准确性和降低室间差异具有重要的现实意义，同时也为辅助病理诊断和预测临床靶向的疗效提供更为准确的依据。

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荧光原位杂交是依据碱基互补原理，应⽤荧光素直接或间接标记的核酸探针，在组织切⽚、细胞涂⽚、染⾊体铺⽚上检测间期细胞核染⾊质数量及结构变化，进⾏定性和相对定量的分析检测技术。荧光原位杂交主要⽤于病理的辅助诊断及鉴别诊断、疾病预后评估和指导临床靶向等，是近⼗年来在临床病理检测中运⽤最为⼴泛的⼀种分⼦细胞遗传学诊断技术。

⼀、荧光原位杂交检测的组织处理壁炉门

国内发表的临床诊疗指南及共识中都涉及对组织处理的要求，技术⼈员应及时了解并掌握最新进展，并根据国内检测指南的更新⽽做出调整。

⼀）标本类型

1、遗传病：外周⾎、⽺⽔、绒⽑、胎⼉脐带⾎制备的染⾊体，或⽺⽔和绒⽑的间期细胞。

2、⾎液病：外周⾎或⾻髓的染⾊体或间期细胞。

3、实体肿瘤（包括⾻髓活检）：理论上讲，任何含有⾜够癌细胞或DNA的组织、细胞或体液（如胸⽔、腹⽔等）标本都可进⾏相应的基因状态检测，但必须依据相应现⾏的临床诊治指南来选择。

⼆）标本固定

1、遗传病和⾎液病（除⽯蜡包埋⾻髓活检标本外）：染⾊体或细胞制⽚后，50～60℃烤⽚2⼩时。

2、细胞学标本：细针穿刺标本，取样后应⽴即95%⼄醇固定；胸、腹⽔标本取样后，优先建议沉渣包埋制备细胞蜡块，离⼼后，95%⼄醇或3.7%中性缓冲甲醛液固定；对于细胞量过少或不具备制备蜡块条件的实验室，取样涂⽚后⽴即95%⼄醇固定。

3、组织学标本：组织离体后尽可能在30～60分钟内将组织按规范剖开，置于不少于⾃⾝体积4～10倍的3.7%中性缓冲甲醛固定液（pH7.2～7.4）中固定6～72⼩时【1-4】。固定液的pH值会直接影响蛋⽩及核酸的含量【1,2】。组织学标本过度固定或固定不⾜都会导致检测结果的变化。

三）标本脱钙

⾻组织及钙化病灶固定后，需要先将钙盐除去使组织软化，以便于后续的临床检测。传统的脱钙剂（盐酸）会显著降解DNA和RNA，⽆法保证荧光原位杂交检测结果的准确性，脱钙剂⼄⼆胺四⼄酸（EDTA）可以在脱钙过程中保护DNA，但脱钙时间会延长⾄48⼩时【5,6】。

四）组织脱⽔、透明、浸蜡

实验室需根据⾃⾝的实际情况，通过严格的测试，制定标准化的组织脱⽔、透明、浸蜡流程以及试剂更换程序。建议使⽤⾃动组织脱⽔机和梯度⼄醇脱⽔⽅案，如70%⼄醇→85%⼄醇→95%⼄醇×2→⽆⽔⼄醇×2。根据处理的组织类型和⼤⼩以及脱⽔机的⼯作效率，每种梯度的⼄醇作⽤时间可设定为60～120分钟。根据处理组织的数量和试剂使⽤时间及时进⾏更换，脱⽔时间不⾜或试剂更换不及时均会导致后续染⾊、杂交效果不佳。

五）组织切⽚

根据检测要求⽯蜡切⽚厚度为3～5µm，贴于阳离⼦或正电荷（或类似的）等专⽤防脱载玻⽚上，确保切⽚与载玻⽚间没有⽓泡。切⽚在空⽓中略微⼲燥后应⽴即烤⽚，推荐标准温度为65℃烤⽚不少于2⼩时。荧光原位杂交未染⾊的切⽚置于室温不宜超过6周【3,7】。

置于室温不宜超过6周【3,7】。

⼆、荧光原位杂交检测步骤

荧光原位杂交检测根据检测标本的不同，操作步骤略有差异，主要流程包括：预处理、变性/杂交、杂交后清洗等环节。荧光原位杂交新项⽬开展之前，应进⾏包括⽅法学及试剂等性能验证，建⽴符合实

验室的标准化操作流程，以确保结果的准确性。

⼀）脱蜡

烤好的组织切⽚需经过脱蜡处理，⼆甲苯脱蜡不⾜会导致探针杂交强度和杂交效率降低、荧光背景⾼等，影响实验结果。因此脱蜡使⽤的⼆甲苯必须及时更换，通常⾄少每两周更换⼀次，并可根据实际情况延长脱蜡时间；脱蜡过程中产⽣的有机废物需进⾏回收处理【8-10】。

⼆）预处理/酶消化

1、切⽚预处理：在现阶段，预处理常见试剂有1mol/L硫氰酸钠、30%酸性亚硫酸钠、10mmol/L柠檬酸、去离⼦⽔等；处理⽅法有⾼温⽔浴、⾼温⾼压等；预处理温度50～120℃不等。处理程序会因组织类型不同⽽有差异。

2、酶消化处理：对切⽚进⾏酶消化，常⽤的蛋⽩⽔解酶有胃蛋⽩酶和蛋⽩酶K。不同批号、不同⼚商的胃蛋⽩酶活性不同，消化能⼒也存在⼀定的差异。酶消化的作⽤是分解包围靶DNA的蛋⽩质，以增加探针与靶核酸结合的机会，提⾼杂交信号。酶消化注意事项：①酶的浓度过⾼、消化时间过长或孵育温度过⾼，会对细胞的结构有⼀定的破坏，细胞核消失或细胞核辨认不清，也会造成⼀定程度的组织脱⽚；②酶消化不⾜会造成蛋⽩消化不透彻，降低组织的通透性以及杂交信号的强度和杂交率；③消化酶均为现⽤现配，且⼯作液使⽤时间<24⼩时【11-13】。

双端面机械密封3、梯度⼄醇脱⽔：将组织切⽚依次置于70%⼄醇、85%⼄醇和100%⼄醇中各2分钟脱⽔，⾃然晾⼲。注意事项：切⽚必须充分脱⽔晾⼲，避免造成信号减弱或者杂交失败。

三）探针的应⽤

1、探针的配制：国内常⽤的探针有即⽤型和⾮即⽤型，即⽤型探针可直接点样杂交，操作简便。⾮即⽤型探针是需要操作者将探针与杂交缓冲液按⼀定⽐例配制，配制⽅法参照探针⼚商说明书。注意事项：①探针不宜反复冻融，可适当分装；②震荡旋涡时需轻柔；③充分混匀，如果混匀不均，会导致杂交信号微弱或⽆信号【3,8,9】。

2、探针的加样：参照选⽤⼚商推荐或经过本实验室有效性验证纳⼊标准化操作流程⽂件的探针加样量，加到待杂交组织中央处，使⽤合适的盖玻⽚，橡胶⽔泥密封四边。注意事项：①探针的使⽤和配制遵照本单位选⽤试剂的产品说明书操作；②盖玻⽚⼀般采⽤硅化盖玻⽚或⽆菌的蜡膜；③注意环境光强度，避免太阳光或强烈的光照；④加盖玻⽚时注意不要留有⽓泡，避免因⽓泡造成⼲⽚现象，导致⽆杂交信号或杂交率降低；⑤盖玻⽚边缘封胶不严密也会出现⼲⽚现象。

3、变性及杂交：变性和杂交分为甲酰胺变性杂交（⼿⼯操作）和杂交仪变性杂交（⾃动操作）。前者是将组织切⽚和探针分开进⾏变性，后者是在杂交仪中对组织切⽚和探针共变性，此⽅法可以在⼀定程度上降低⼈为因素的影响。根据所选⽤⼚家探针的要求，设定共变性杂交条件，可选变性温度和

时间：72～95℃，3～5分钟，杂交温度和时间：37或42℃，16～18⼩时。注意事项：为避免杂交液在变性和杂交过程中的损失及防⽌⼲⽚，⼀定要在盖玻⽚的四周⽤橡胶⽔泥进⾏密封。

4、杂交后处理：杂交后处理的⽬的：①洗去多余的未结合的探针；②洗去⾮特异度结合的探针⽚段，有效降低杂交背景。杂交后洗涤⼀般遵循的共同原则：盐溶液浓度由⾼到低⽽温度由低到⾼。可选择的洗液有0.3%NP-40/2×SSC溶液、0.1%NP-40/2×SSC溶液、50%甲酰胺/2×SSC等，具体请参照相应⼚家的试剂说明书。注意事项：①在漂洗的过程中，切勿使切⽚⼲燥；②影响洗涤的因素有：洗液中NP-40的浓度、洗涤时间、洗涤温度、洗液pH值【10,13-15】。

5、对⽐染⾊、封⽚：在杂交区域位置滴加⾜够量的DAPI复染剂，⽴即盖上盖玻⽚，-20℃冰箱内存放。注意事项：

①4,6-⼆咪基-2-联苯基吲哚（DAPI）是⼀种毒性物质与致癌物，操作过程中应注意个⼈防护措施。如不慎接触，⽴即⼤量⽔冲洗【11,13】。②注意避光，紫外线会造成荧光淬灭。③宜选⽤较⼤盖玻⽚或是选⽤指甲油在盖玻⽚四周封⽚。可以有效避免阅⽚时镜油的渗⼊对信号观察的影响。荧光原位杂交结果应⽴即照相存档并将切⽚置于-20℃保存，建议⾄少保存3个⽉备查，有条件的可以保存1年以上，仍可见清晰信号【3,7】。

三、结果判读

为尽可能减少荧光原位杂交计数的⼈为误差，建议每例标本的荧光原位杂交切⽚⾄少由两名有资质的检验/检查⼈员计数判读，特别是出现荧光原位杂交结果不确定时【3,16】。

由于荧光原位杂交探针杂交的区段长，在组织或细胞块切⽚中，可能出现⼈为的信号异常，如缺失、分离等。所以必须在⼀定数量的细胞中（20、50或100个细胞）计数杂交信号，当具有阳性信号的细胞数达到⼀定数值时，检测标本才能视为阳性，这⼀数值即为阈值（临界值，通常为阳性信号的细胞百分⽐）。阈值设定：参照⾏业指南/共识、探针试剂说明书或实验室⾃设阈值（所有标本的检测结果计算，算术平均数＋3倍的标准差定为该指标的阈值），经实验室验证后使⽤，验证⽅法参照⽅法学验证。

对于辅助临床诊疗的荧光原位杂交检测，其阈值设定需要考虑因素包括。

1、探针的灵敏度和特异度：综合考虑探针类型（如分离探针、计数探针等）、长度（位点特异性探针、着丝粒探针等）、来源（不同⼚家不同的实验条件要求）等，进⾏室间评估验证，其⼀致性应在95%以上【17】。

2、技术⽅法的灵敏度和特异度：与已知⽅法相⽐，确认可检出的最少异常细胞数和异常细胞数的阳性检出率。

3、临床应⽤的有效性：指在确认探针和⽅法的有效性后临床应⽤的效果，需要⼤量临床数据积累。⽬前，已有临床指南的荧光原位杂交探针应⽤项⽬包括：乳腺癌HER2基因的荧光原位杂交检测，参考指南是《乳腺癌HER2检测指南（2019版）》【3】；胃癌HER2基因的荧光原位杂交检测，参考指南是《胃癌HER2检测指南（2016版）》【4】；肺癌ALK基因的荧光原位杂交检测，参考指南是《中国间变性淋巴瘤激酶（ALK）阳性⾮⼩细胞肺癌诊疗指南（2015版）》【18】。此外，上述与临床诊疗相关的荧光原位杂交检测项⽬在更新中，应根据指南的变更做出调整。

4、由于肿瘤细胞染⾊体改变的复杂性，可能出现与预期有差异的信号改变（即不典型杂交信号）：如染⾊体易位分离探针检测出基因扩增的信号，或者参考染⾊体信号丢失或增多，这时应结合病史、病理特征及探针信息综合分析，参考⽂献给予合理解释。

对于常⽤探针类型检测的结果判读，⼀般的要求是：①基因扩增：单⾊探针通常计数每个肿瘤细胞信号的绝对量，⽽双⾊探针则计算每个肿瘤细胞靶基因位点信号与参考染⾊体信号的⽐值。②染⾊体易位：可发⽣在染⾊体内（以分离探针信号之间达到1～2倍信号直径的间距判定易位）或染⾊体间（⼀般必须有清楚的独⽴信号）。少数情况下，易位也可出现其中⼀个分离探针信号的丢失。③基因缺失：在应⽤单⾊探针（即没有参考染⾊体探针）时，需要增加计数细胞的数量，避免由于切⽚导致的信号缺失⽽判读为阳性结果。④双⾊探针以上的多⾊探针对其中的每种信号可以有不同的阈值要求。

四、质量控制

荧光原位杂交质量控制是指采取不断优化的措施和技术以及制定实验室制度和⼯作规范，完善实验室操作流程与步骤，保证荧光原位杂交染⾊质量达到最佳结果，并可以做出准确诊断。荧光原位杂交质量控制贯穿于检测的全流程。荧光原位杂交检测过程中任⼀步骤的调整及试剂的更换均应记录在案，并进⾏相应的性能验证。荧光原位杂交质量控制包括室内质控和室间质量评价（简称室间质评）。

⼀）室内质控

指荧光原位杂交实验室内部的质量控制，包括试剂质控、⼈员质控、设备及场地质控、荧光原位杂交实验流程的质控。

1、⼈员质控：实验室应⾄少具有2名检验/检查⼈员【19】，根据病理实验室主管部门相应法律法规要求，参与荧光原位杂交染⾊的病理技术⼈员应具备分⼦⽣物学或相关专业学习背景，由相应资质的培训机构经过⼀定的荧光原位杂交理论岗前学习培训和实际操作培训，并通过相关培训考核合格⽅可上岗。对于使⽤全⾃动及半⾃动染⾊设备的操作⼈员，同时还应具备染⾊设备的使⽤维护上岗资格。已获得上岗资质的⼈员每年应进⾏⼀次科内能⼒评审。对新进员⼯在最初6个⽉内应⾄少进⾏2次能⼒评审，保存评估记录。当职责变更时，或离岗6个⽉以上再上岗时，或政策、程序、技术有变更时，应对员⼯进⾏再培训和再评估，合格后才可继续上岗【19】。实验室应建⽴⼈员档案，并制定⼈员年度培训及定期考核计划。

2、试剂质控：①新试剂⼊院，应遵循医院新试剂⼊院流程，其中靶向相关指标的检测试剂应按照2017年12⽉国家⾷品药品监督管理总局对相关试剂的要求选择（如HER2荧光原位杂交探针，需要具备三类试剂证）。⼊院后新开展的项⽬应进⾏性能验证，包括⽅法学验证及试剂验证。⽅法学验证包括检测⽅法的准确性、稳定性以及重复性。参考国家医药⾏业标准YY⁄T1261-2015HER2基因检测试剂盒（荧光原位杂交法）【20】，按本实验室建⽴的⽅法制备相应数量的玻⽚，检测结果由两⼈同时评估，重复两次，评价在不同判读者和不同标本间的重复性，以保证⽅法的准确性和重复性。

⽚，检测结果由两⼈同时评估，重复两次，评价在不同判读者和不同标本间的重复性，以保证⽅法的准确性和重复性。

②试剂性能验证：当已经验证的检测⽅案出现任何⼀种变化时，实验室应利⽤⾄少2例已知阳性标本和2例已知阴性标本对检验⽅案进⾏性能验证，验证结果⼀致后，记录在案后⽅可使⽤。③试剂质控：经过筛选的可靠试剂购⼊实验室后，应⽴即进⾏试剂验收并在最短时间内进⾏试剂性能验证。④组织处理的质控：标准的组织前处理是获得合格原位杂交制⽚的前提，组织的前处理过程涉及病理科取材、固定、制⽚多个环节。组织处理应严格按照实验室相关标准化操作流程⽂件的要求进⾏。⑤相关设备质控：包括设备使⽤⼈员、设备所处环境条件、相关设备、使⽤/维护等。⑥荧光原位杂交切⽚质控：包括切⽚厚度、切⽚时间以及切⽚的脱蜡等步骤。⑦对照设置：设置对照（包括设置阳性对照、阴性对照）是验证操作步骤是否正确、染⾊结果是否准确的关键。对于与肿瘤靶向药物相关

偏心井口的检测项⽬（如HER2、ALK 等），必需设置对照。对照的设⽴应参照国内检测指南/专家共识设置，对于没有指南/共识的项⽬应设⽴阴性及阳性对照，以确保结果的可靠性。

⼆）室间质评

室间质控是指为确保实验室维持较⾼的检测⽔平⽽在不同实验室之间对其能⼒进⾏考核、监督和确认的⼀种验证活动，主要是为了检查操作和实验室的实验条件是否过关。新开展荧光原位杂交检测的实验室阴性和阳性的检测结果必须与合格的参考实验室结果达到95%的⼀致性【20,21】。建议每个⽣物标志物每年应⾄少参加⼀次全国或省市以及权威机构组织的室间质评【3】，并将室间质评结果进⾏分析存档。国际上的包括美国病理医师学会（CAP）、欧洲分⼦基因诊断质量联盟（EMQN）和英国实验室间质量评定组织（UKNEQAS）等。国内的包括中国合格评定国家认可委员会（CNAS）、国家病理质量控制中⼼（PQCC）等。对于没有室间质评的⽣物标志物检测项⽬或由于每年发放的质控品有限，建议没有申请到的单位可以与通过PQCC、CNAS等官⽅室间质评的实验室之间做室间⽐对。

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