一．双杂交系统原理及应用范围
蛋白质之间的互作是很多反应机制分子水平的核心动作，如DNA合成、转录激活、蛋白质翻译、蛋白质定位和信号转导等所有的的反应的完成都涉及到蛋白质复合体的作用。而随着酵母双杂系统的成熟和完善，其在蛋白质互作研究中的应用越来越广泛。酵母双杂交系统是基于转录因子的典型结构特征所建立的，它利用了酵母的转录因子GAL4基因产物，该蛋白拥有两个典型的转录因子结构域DNA结合结构域（BD）与转录激活结构域（AD）。前者结合GAL1启动子区的DNA序列，后者则激活转录（Fields and Song，1989）。Fields和Song分别构建了含有含有编码GAL4 DNA结合结构域（GAL4BD）和GAL4转录激活结构（GAL4AD）序列的载体。将我们所要研究的目的基因分别装载到这两个质粒载体中，两个结构域序列则分别与基因的ORF进行融合。当转入相应酵母菌株后，若在酵母内表达的不同蛋白发生互作，则将使GAL4-BD和GAL4-AD相互靠近结合，再进一步与上游激活序列结合，激活相应报告基因（report gene）的表达。 特点与优点
酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点：（1）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。（2）检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。（3）检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
局限性和存在的问题
酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法，有多方面的应用，但仍存在一些局限性。（1）双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋
白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。
另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。（2）酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。由于某些蛋白本身具有激活转
录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。
二．酵母双杂交所需菌株及质粒载体
菌株：AH109、Y187(用于mating)
质粒：pGBKT7 DNA-BD V ector (bait) pGADT7 AD V ector (prey)
pGBKT7-53 Control V ector pGBKT7-Lam Control V ector
pGADT7-T Control V ector
3.1培养基的配置
酵母基本培养基
YPD:
20g/L Peptone, 10g/L Y east extract, 2% Dextrose(glucose) (20g/L), 20 g/L Agar (for plates only)，加ddH2O至1L，调节PH值到6.5（实际操作中可以不用调试）,121 15分钟。
中央空调通风管道Tips：葡萄糖应先配成40%的母液，与培养基分开灭菌，待培养基温度降至55°C左右时另外计量加入。否则，培养基中的葡萄糖易碳化使其颜变褐。
YPDA(YPD + adenine):
0.2% adenine hemisulfate高温灭菌后保存。1LYPD培养基中加15mL 0.2% adenine hemisulfate(硫酸腺嘌呤)，终浓度0.003%。混合后121 C15分钟。
SD营养缺陷型培养基：
不同类型的SD营养缺陷型培养基针对不同的实验目的：
SD/-Trp；SD/-Leu；SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade，SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal
SD/–Trp/X-α-Gal；SD/–His/–Trp/X-α-Gal；SD/–Ade/–Trp/X-α-Galpeepm
6.7 g Yeast nitrogen base without amino acids（YNB：无氨基酸氮源），2%dextrose (glucose)，20 g Agar (for plates only)，850 ml ddH2O，100 ml 灭菌保存的10×Dropout Solution。调节PH 值到5.8（实际操作中可不做调试）。121︒C 15分钟。
Tips：glucose、Dropout Solution及X-gal应先分别配成40%和10倍的母液，与培养基分开灭菌，待培养基温度降至55°C左右时另外计量加入。
3.2 相关试剂的配置
• 10X Dropout (DO) Solution
多数的常用DO可从CLONTECH公司买到。或者可以结合下面营养成分列表中标明的浓度，自己配制10X DO溶液。
10XDO溶液中含有除一种或少数几种之外的其他所有下面列举的营养成分。10XDO溶液可经过高压灭菌，4℃保存一年以上。由于在整个实验过程中，依据不同的实验目的，不同缺陷型培养基的消耗量不一致，通常用的最多的是SD/-Trp；SD/-Leu；SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade。所以，在进行实验前10 X DO溶液的准备时，需要事先计算好实验用量，避免造成不必要的浪费。
1L 10X Dropout (DO) Solution配置所需氨基酸用量如下：
• 200 mg adenine hemisulfate 腺嘌呤
• 200 mg arginine HCl 精氨酸
• 200 mg histidine HCl monohydrate 组氨酸
• 300 mg isoleucine 异亮氨酸
• 300 mg lysine HCl 赖氨酸
• 200 mg methionine 甲硫氨酸
• 500 mg phenylalanine 苯丙氨酸
• 2000 mg threonine 苏氨酸
• 300 mg tyrosine 酪氨酸
• 200 mg uracil 尿嘧啶led灯控制器
• 1500 mg valine 缬氨酸
• 1000 mg Leucine 亮氨酸
• 200 mg Tryptophan 氨酸
1 L 溶解于1L ddH2O中，121︒C 15分钟灭菌保存。
例如：如果要配置10X –Leu DO Solution，则需要在上述13种氨基酸中减少亮氨酸即可。
Tips：氨基酸晶体/粉末较难溶于ddH2O，可直接高压灭菌后充分震荡，此时，氨基酸晶体/粉末即可充分溶解。
• 10× TE buffer：
0.1 M Tris-HCl，10 mM EDTA，pH 7.5。121︒C 15分钟灭菌保存。
• 10× LiAc：
1 M 醋酸锂，需调节pH值至7.5。121︒C 15分钟灭菌保存。
• 1.1×TE/LiAc Solution：
10× TE buffer 1.1ml
英姿带10× LiAc 1.1ml
ddH2O 7.8ml
•PEG/LiAc solution：
PEG3350(50%，单独配置，121︒C 15分钟灭菌保存。) 8ml
10× TE buffer 1ml
10× LiAc 1ml
Tips：1.1×TE/LiAc Solution和PEG/LiAc solution制备酵母感受态及转化操作时应现配现用，不要配置成混合溶液存放。
•酵母filter-lift显反应：
Z buffer：Na2HPO4• 7H2O 16.1 g/L
NaH2PO4• H2O 5.50 g/L
KCl 0.75 g/L
MgSO4• 7H2O 0.246 g/L
pH调至7.0高压灭菌后，可室温存放一年以上。
Z buffer/X-β-gal solution（显液）
/100 ml Z buffer
0.27 ml β-mercaptoethanol
1.67 ml X-β-gal stock solution（20 mg/ml）
•X-β-gal：
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。(即通常所说的X-gal)。价格相对便宜，要检验酵母的半乳糖苷酶活性必须破除细胞壁。
•X-a-gal：
5-溴-4-氯-3-吲哚- a -D半乳糖苷。价格昂贵，可以在涂布的平板上直接检验酵母体的半乳糖苷酶活性。
Tips： X-a/β-gal用DMF溶解，浓度为20mg/ml。-20℃避光保存。
对于X-a-gal平板，1L缺陷培养基中冷却至55℃后加入1ml X-a-gal（20mg/ml）再倒平板。或者每块冷却后的10cm/15cm平板上涂100ul/200ul X-a-gal（2mg/ml）。对于X-β-gal，采用通常的filter-lift方法检验（后面详述）。
四．酵母双杂交实验技术
4.1 酵母菌的菌株活化、保存及显反应
•酵母菌株的保藏和培养：
酵母菌株可以于含25%甘油的YPD培养基中保藏在-70℃，若温度始终保持在-55℃以下，至少可以保藏1年以上。
转化后的酵母菌应保藏在对应的SD培养基内，以始终保持选择压力。
•酵母甘油菌种的制备：
a. 无菌操作，从平板上刮下一个酵母单克隆。
b. 1.5ml无菌EP管中，用200–500 μl YPD培养基或适宜的SD培养基重悬菌落。剧烈震荡，
完全分散细胞。加入50%的甘油等体积，使甘油终浓度为25%。
c. 盖紧盖子，再次混匀EP管。-70℃包藏。
•酵母甘油菌的复苏：
a. 挑取少量冻存的甘油菌在YPD或相应的SD平板上划线。
b. 30︒C培养3～5天，直到菌落直径为2mm以上。将这些作为“工作菌”平板。
c. 将平板用封口膜封好，4︒C可保藏2个月以上。每过1～2个月重新从冻存的甘油菌中划
平板。
d. 甘油菌一般可被反复冻融有限几次而不影响细胞。如果没有活化出来，可能是因为酵
母细胞沉淀在EP管底部。则此时可将EP管置于冰上解冻后，震荡混匀并重新划线。
•酵母菌的过夜培养：pppd-287
a. 从“工作菌”平板上取新鲜的(≤4周，2-3mm)克隆用于实验。每5ml培养基接种一个
较大的克隆(直径2–3-mm) ；若菌落较小或者使用了更多的培养基，可以根据实验需求取多个克隆（如扩大培养mating用bait时，有时由于文库浓度过高，bait单克隆培养浓度无法达到对prey浓度的覆盖要求时）。
Tips：挑斑后应充分地剧烈振荡培养基，以彻底分散团聚的酵母细胞。
b. 30︒C培养16～18小时，230–270 rpm。对于大多数的菌株，培养物将达到生长的平台
期(OD600 > 1.5)。
Tips：不同酵母株系的生长速率不同。同时在一些转化子中，生长速率还会受到融合
蛋白的影响。另外，大多数株系在SD培养基中的加倍时间要比在YPD中长。
c. 如果需要对数生长期的培养物，转移足够的过夜培养物到新鲜的培养基中，使OD600 =
0.2–0.3。30︒C培养3～5小时，230–250 rpm。对于大多数的菌株，OD600可达到0.4～
0.6 。
Tips ：在这个活化步骤中通常使用YPD或者YPDA。因为在这种较短的活化时间下，质粒的丢失并不明显。
•液氮破酵母菌后，X-β-gal显方法：
1. 选取在平板上新鲜生长的酵母菌落进行显反应。生长时间过长的酵母可能会影响激
活报告基因的能力。
自动埋钉机2. 选择合适大小的滤纸，在滤纸上做好相应的标记后，用水将其均匀润湿，以刚浸湿滤
纸为益。
3. 用头或牙签刮取少量菌落（无菌操作），均匀涂布在滤纸上。菌需要均匀涂开，较
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