动物学杂志Chinese Journal o f Zoology 2005,40(5):61～67
张 明①
侯 蓉②
郑鸿培①
朱 庆
①3
张志和② 刘玉良
②筛板塔
(
)
中图分类号:S86313;Q953;Q813 文献标识码:A 文章编号:025023263(2005)05261207
Establishment and Cryopreservation of a G iant P anda
Skin Fibroblast Cell Line
ZH ANG Ming ①
H OU R ong ②
ZHE NG H ong 2Pei
①
ZH U Qing
①
ZH ANG Zhi 2He
②
LI U Y u 2Liang
②
(①College o f Animal Science &Technology ,Sichuan Agricultural University ,Ya ′an 625014;
②G iant Panda Breeding Research Base in Chengdu ,Chengdu 610081,China )
Abstract :The paper describes the process of establishment and cry opreservation of a G iant Panda (Ailuropoda melanoleuca )skin fibroblast cell line.Firstly ,the skin tissue was digested with 200I U Πml collagenase type Ⅰunder
4℃.Secondly ,we added 100I U Πml penicillin and streptomycin ,5μg Πml M 2plasm ocin
T M
黑刚玉磨料,5μg Πml Amphtericin B ,2
mm ol ΠL L 2G lu ,10μg Πml insulin 40ng Πml epidermal growth factor (EG F )and 20%(the first passage )or 10%(after the first passage )fetal bovine serum (F BS )into DME ΠHam ’s F12and M199,and then cultured dispersive cells in DME ΠHam ’s F12and tissue pieces in M1991Finally ,G iant Panda skin fibroblast cells were cry opreserved in phosphate balance s olution (P BS )containing 014%bovine serum albumin (BS A ),011m ol ΠL sucrose and 10%dimethyl sulphoxide (DMS O ).Living cell percentage was 931258%after thawing of cells half a year after cropreservation.Thawed fibroblasts still grow well in culture ,showing the success ful establishment and cry opreservation of a G iant Panda fibroblast cell line.
K ey w ords :G iant Panda (Ailuropoda melanoleuca );Fibroblasts ;Culture ;Skin
基金项目 成都大熊猫繁育研究基金项目(N o.2001003);3通讯作者;
第一作者介绍 张明，讲师，博士研究生；主要从事动物繁殖生物技术相关研究;E -mail :zhm3000@163 。收稿日期:2005203204，修回日期:2005207215
大熊猫(Ailuropoda melanoleuca )是我国特有
的珍稀濒危动物，由于其繁殖力低下、栖息环境不断缩小和割裂、遗传交流中断、遗传多样性逐渐丢失，加上人为干扰等原因，野生大熊猫的数碎片文件
量急剧减少，已处于濒临灭绝的境地[1]
。大熊
猫具有珍贵的遗传价值，是人类共同的财富。对大熊猫遗传资源进行保护和研究，已迫在眉睫。
通过对细胞培养，选育大熊猫遗传资源细胞系，建立大熊猫遗传资源细胞库，可以与大熊猫配子库、胚胎库一起，形成多层次、多角度、全 方位的遗传资源保藏系统[2]
。细胞培养不仅可以使大熊猫的遗传资源扩大，得到长期保存，而且可以为研究者提供丰富的研究材料，更有利于开展大熊猫保护的世界性联合研究。本文扼要地介绍了成都大熊猫繁育研究基地的大熊猫皮肤成纤维细胞建系过程和冷冻保存方法。该建系方法已经成功的应用于015～8岁年龄阶段大熊猫皮肤成纤维细胞的培养。
1 材料与方法
111 实验材料 015～8岁的大熊猫共18只,
来自成都大熊猫繁育研究基地。大熊猫麻醉
后，股内侧剃毛消毒(碘酒消毒后立即用75%的酒精脱碘)后，用9～12号针头挑起皮肤，再按与针尖垂直的方向切割挑起的皮层，每块皮
肤约2～3mm 2
，然后迅速将其放入含500I U Πml 青链霉素(长征制药二厂)的P BS 液中(自配制),4℃下保存备用，保存时间最好不超过48h 。112 实验方法11211 皮肤组织细胞的分离 将大熊猫皮肤
组织在含100I U Πml 青链霉素的Hank ’s 液(HyClone ,AME16016)中洗涤3次，每次浸5min 后1000r Πmin 离心后放在吸水纸上晾干。用电子天平称重皮肤组织块，然后在4℃下用200I U Πml 的胶原蛋白酶Ⅰ(G ibco BR L ,1021082)持续酶解时间36～48h 。酶解过程中随时观察，待皮肤组织呈絮状时停止酶解。细胞悬液洗涤后用血球计数法测量细胞密度，计算细胞得率。11212 植块培养 按照11211中的方法将皮肤组织块清洗，然后剪碎成1mm 3
的小块。将组织块在M199(HyClone ,AME16086)中添加100I U Πml 青链霉素、5μg Πml 两性霉素B (Sigma ,
171375)、5μg Πml M 2Plasm ocin T M
(Inviv oG en ，晶美分装,2421032MPP )、2mm ol ΠL L 2G lu (G ibco BR L ,
1062503)、10μg Πml 的胰岛素(Sigma ,I5500)、40ng Πml EG F (Inviv oG en ,1120677)和20%F BS (HyClone ,AK B11420)组成的原代培养液浸润。
再将组织块移入50ml 培养瓶(FA LC ON ,353014)瓶底，将瓶翻转，加入2ml 原代培养液，静置12h ，将瓶轻轻翻转，让培养液浸没组织块，漂浮的组织块吸出。每2d 更换2Π3的培养液。当组织块周围长出细胞铺满瓶底80%时，用0125%胰蛋白酶(G ibco BR L )消化脱壁传代。传代培养液添加10%F BS 。11213 贴壁培养 将植块培养中M199换成在DME ΠHam ’s F12(HyClone ,AME15972)组成培养液。F BS 添加和传代与植块培养相同。培养时，将酶解获得的细胞用培养液调整浓度到2×105
～4×105
个Πml ，每个50ml 培养瓶中添加2ml ，静置6h 后再添加相应培养液3ml 。换液传代同11212中的方法。贴壁培养时，根据上皮细胞和成纤维细胞差速粘附特性将其分离。具体做法是：室温下消化贴壁
细胞5min ，未脱壁细胞丢弃；传代接种细胞6h 后，吸出培养瓶中悬浮细胞。消化时容易脱壁和接种后贴壁快的细胞主要是成纤维细胞。
11214 培养条件 所有培养液调节pH 值为712。在饱和湿度,5%C O 2,3712℃的环境条件下进行培养。
11215 生长速度测定 取贴壁培养传至第6
代的细胞，按11673×105
deepbit个每孔接种015ml 细胞悬液到12孔板培养板(FA LC ON ,353043)，每隔12h 消化1孔测定细胞个数,8个重复。然后以测定次数为横轴，细胞个数为纵轴绘制细胞生长曲线。11216 核型分析 取第5代细胞，用秋水仙碱(Sigma ,31K 1534)处理后进行核型制片，具体方法见参考文献[3]，并将核型片制作成临时装片。分析116个细胞的核型，根据细胞染体数目(N )，将其分成亚单倍体(N <21)、单倍体(N =21)、亚二倍体(21<N <42)、二倍体(N =42)、超二倍体(42<N <63)和多倍体(N ≥63)6种类型，并分别计算每种类型细胞所占的百
分比，通过染体数目变异率测试，衡量细胞体
・26・ 动物学杂志Chinese Journal o f Zoology 40卷
外培养的遗传特性。根据核型确定培养细胞来
源的动物种属。
11217 细胞冷冻保存和复苏 在P BS (Sigma 药品自配)中添加014%BS A (G ibco BR L )、011m ol ΠL 蔗糖(G ibco BR L )，然后再添加10%DMS O (Sigma )组成冷冻保存液，用细管(FHK 牛冻精管)分装细胞，按程序(4℃下平衡1h ;-25～4℃,1℃Πmin ;-80～-25℃,10℃Πmin ;-80℃时直接投入液氮)冷冻细胞，液氮中保存半年后
解冻培养。用55～60℃温水快速解冻，用培养液洗细胞3次。用贴壁培养液进行培养。
lw24-40.52 结 果
211 皮肤组织分离效果 由于大熊猫年龄和
组织块大小的差异，酶解分离时间一般需要36～48h 。酶解后的皮肤组织呈絮状悬浮物，其
中最上层为非细胞悬浮物，紧接着是单细胞层，中层为细胞团，最下层为毛根和未被消化的皮肤表层。酶解所得的细胞悬液经离心洗涤，取中层悬液，其他非细胞成份含量会大大减少(图版Ⅰ:1,2)。大熊猫皮肤组织酶解分离的细胞平均得率为51079×106
个Πg 。212 植块培养 用M199进行组织块培养时，幼仔熊猫(出生50d 左右)的皮肤组织块在培养6～8d 左右可看见梭状的成纤维细胞从组织块周围长出(图版Ⅰ:3)。在50ml 的培养瓶中放6块皮肤组织时，铺满瓶底需要26～32d ;
成体(2岁或2岁以上)大熊猫的皮肤组织块在培养12～14d 左右可以看见梭状成纤维细胞从组织块周围长出。在75ml 的培养瓶中放6块皮肤组织时，铺满瓶底需要50～60d 左右。植块培养获得原代细胞主要为成纤维细胞。213 成纤维细胞的纯化 在贴壁培养原代，培
养细胞主要为上皮样细胞和成纤维细胞，两类细胞在生长过程中往往形成同种细胞集落(图版Ⅰ:4)，同种细胞集落形成表明：培养细胞存在运动现象和细胞间联系。酶解分离得到的上皮样细胞和成纤维细胞贴壁后的形态差异较大：贴壁生长的成纤维细胞成梭形长条状或不规则状(图版Ⅰ:5)。上皮样细胞多呈扁平的多角形,
细胞之间紧密相连，成片状(图版Ⅰ:6)。经过连续3代成纤维细胞和上皮细胞的差速粘附分离后，得到的主要是成纤维细胞。
214 细胞生长速度 生长速度测定中，以
11673×105
个细胞接种后共测定10次，测得细
胞的个数依次为:11229×105、21201×105
、21430
×105、21973×105、41231×105、61089×105
、61890×105
、61089×105
、51661×105
和61118×105
个。绘制的生长曲线见图1。从细胞的生
长曲线可以区分出细胞生长的前3个时期：潜
伏期约12h ，增殖期约72h ，平台期和衰退期区分不明显，细胞数量呈波动下降状态。215 染体数目变异率和核型分析分析 染体变异率分析中，各种染体数目(N )类型
图1 成纤维细胞的生长曲线
Fig.1 G row th curve of fibroblast
・
36・5期张 明等：大熊猫皮肤成纤维细胞系的建立和冷冻保存
的百分比为：亚单倍体(N <21)占2190%，单倍体(N =21)占1145%，亚二倍体(21<N <42)占16109%，二倍体(N =42)占74177%，超二倍体(42<N <63)占4180%，多倍体(N ≥63)占0%。统计的116个核型中，染体数目范围是15～49，染体数目众数是42。体外培养细胞基本
维持了二倍体特性，数据见表1。
将贴壁培养的大熊猫皮肤成纤维细胞进行核型分析。染体比较清晰的细胞进行放大、测量、统计、分组、编号，将染体的相对长度和
着丝粒指数与陈大元等
[4,5]
(1991)发表的大熊猫染体组型进行比较，数据见表1。
表1 大熊猫染体相对长度和着丝粒指数
T able 1 R elative length and centromere index of G iant P and a chromosome
染体编号
Chrom os ome N o.
染体类型
Chrom os ome type
相对长度
Relative length
着丝粒指数
Centromere index
测试
T est 对照3
C ontrol 测试值
T est value 对照值3
C ontrol value 测试值
T est value 对照值3
C ontrol value 1m m 81267±015838104±010********±3160746195±016292m m 71573±016217166±01163411770±2140243141±017043m m 61703±014376162±01127401123±2155245112±016804m m 61028±011896112±01110391128±3185
843128±017595sm sm 51870±012845158±01108311508±6141031184±018466m m 51690±011875177±010********±7122745175±017407sm sm 51623±012645147±01107351405±9131232122±017838m m 51278±013315122±01121421163±1172941125±016649m sm 51048±011804192±01101381953±6154036103±0169310m sm 41935±012424192±010********±5143035164±0165411m m 41578±012254162±010********±6113942198±0162712m m 41410±010344144±010********±5188245112±0191513m m 41228±010454136±010********±4166243134±0153114m m 41120±011334114±010********±6138045189±0170915m m 31870±011543190±010********±2186442178±0168316m
m
31720±012363176±010********±41143
45198±01731
1721780±016813154±011501821253±014562113±010*********±011711190±010*********±012241179±01036X
m
m
51353±012605151±01083
421668±5106040136±01606
Y
11260±01058
3对照值来自陈大元1991年发表的大熊猫核型数据。
3The control value is from the kary otype data which were published by CHE N D Y in 19911
培养细胞的染体众数为42，与大熊猫正常核型的染体数目一致。经配对试验t 2检验，染体相对长度的测量值与理论值之间差异不显著(P >0105)，染体着丝粒指数测量值和理论值之间差异显著(P <0105)。根据着丝粒指数确定的染体类型中，第9、10号染体测量类型为中部着丝(m )，理论类型为亚中部着丝(sm )，这种差异可能主要由测量误差引起，但不排除9、10号染体结构变异的可能
性。
大熊猫染体组型见图2。
216 细胞冷冻保存和复苏 冷冻保存前用014%台盼蓝(G ibco BR L ,25K 1563)染排除法测得细胞活率为951694%，冷冻保存半年后，取出解冻、洗涤后测得细胞试活率为931258%，经
大米淀粉卡方(χ2
)检验，差异不显著。解冻后的细胞以
(91875±111085)×105
Πml 的密度接种2ml 到50ml 培养瓶，经过18h ，细胞铺满瓶底50%以
・46・ 动物学杂志Chinese Journal o f Zoology 40卷
图2 大熊猫染体组型(雄)
Fig.2 G iant P and a k aryotype (male )
上，细胞生长状况良好。3 讨 论
成纤维细胞被广泛应用于细胞或分子生物学研究的许多方面。这主要由于成纤维细胞是最易培养的细胞，在常见的培养液中，已实现传代的成纤维细胞的生命周期约50代。此外，成纤维细胞良好的耐受性使之易于进行从基因转染到微注射等较多领域的研究
[6]
。皮肤成纤维
细胞是存在于真皮及其皮下结缔组织中的一类细胞，在体外培养时增殖较快，要求的培养条件相对容易。因此本研究以培养成纤维细胞为主。
植块培养获得的原代细胞各种特性更接近组织细胞本身
[7]
，但植块培养由于培养液渗入
组织内部困难，细胞的营养物质供应不平衡，细胞之间的接触抑制，使细胞的生长、增殖缓慢，培养经历的时间延长，增加了细胞培养过程污染的可能性。组织块的大小、大熊猫的年龄、取材的部位等因素，也会影响细胞生长、增殖的速度和潜力。一般组织块越小，细胞的增殖越快；大熊猫的年龄越
小，细胞的增殖越快，增殖的潜力越强；取材部位组织的再生能力越强、越幼嫩，角化程度越低，细胞的增殖速度越快，增殖潜力越强。
贴壁培养需要对组织块酶解，可用于解离组织的酶类较多，常见的有胰蛋白酶、胶原蛋白酶和链霉蛋白酶等。胰蛋白酶的酶解能力强,
酶解皮肤组织获得的细胞以上皮细胞为主。皮肤和皮下主要为Ⅰ型胶原，用胶原蛋白酶Ⅰ酶
解的效果较好，容易获得皮肤成纤维细胞。链
霉蛋白酶的细胞毒性较强[8]
。贴壁培养的细胞增殖迅速，需要不断传代，容易获得大量的培养细胞，但细胞原有特性的维持困难，随着传代次数增加，细胞原有的形态、细胞生物学特性逐渐
发生改变[9]
。
作为遗传资源保存的细胞系，遗传稳定性是极其重要的。张德礼等在研究7种动物的肾细胞系(F 218,C
RFX ,CK F ,M DCK,Vero ,Vero 22,M A 2104,BHK 221)和Hela 细胞系中若干细胞株的染体变异率、克隆形成率和肿瘤形成的相互关系时发现：体外培养的细胞系，染体数目
变异是普遍现象[10]
。寻尽可能能够维持遗传资源保存细胞系的遗传稳定性的培养体系，是遗传资源保存细胞建系研究的重点。
细胞冷冻保存是培养细胞得以长期保藏的有效方法。研究表明，科学的冷冻保存方法，对细胞的DNA 结构和遗传稳定性几乎没有影响[11]
。本研究中熊猫皮肤成纤维细胞用014%BS A +011m ol ΠL 蔗糖+P BS +10%DMS O 冷冻保
存半年后，细胞快速解冻的复苏率为931258%，冷冻保存效果与安立龙、常万存的保存效果相当[12,13]。参 考 文 献
[1] 冯文和，叶志勇，何光昕.大熊猫生育能力的研究.四川
・
56・5期张 明等：大熊猫皮肤成纤维细胞系的建立和冷冻保存
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