日用化学品安全性评价
本标准规定体外哺乳动物细胞微核试验的基本原理、规范性引用文件、术语及定义、试验方法、数据处理及结果评价和报告。
本标准适用于评价日用化学品及化学品原料的遗传毒性。 2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
OECD Guidelines for the testing of chemicals:In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test(No.487),2016年
GB/T28646-2012《化学品体外哺乳动物细胞微核试验方法》
3术语及定义
GB/T28646-2012界定的以及下列术语及定义适用于本文件。为了便于使用，以下重复列出了GB/T 28646-2012中的某些术语及定义。
3.1
非整倍体诱发剂aneugen
任何与细胞有丝分裂和减数分裂周期中有关的成分相互作用后导致细胞出现非整倍体现象的物质或因子。
3.2
远程遥控
染体断裂剂clastogen
任何引起细胞或生物体中染体结构畸变的物质或因子。
3.3
胞质分裂cytokinesis
随着核分裂（有丝分裂和减数分裂）之后的细胞质的分裂。
3.4
叉车轮辋细胞阻滞cytostasis液中焚烧炉
细胞生长被抑制。
3.5
细胞毒性cytotoxicity
对细胞结构或功能的有害作用，最终可导致细胞死亡。
3.6
微核micronuclei
独立于细胞核主核以外的小核，由有丝分裂或减数分裂末期滞后的染体片段或整条染体构成。
3.7
胞质分裂阻断增殖指数cytokinesis-block proliferation index,CBPI
使用细胞松弛素B时计算细胞毒性的方法。处理组中二次分裂细胞数相对于对照组的比值。
3.8
复制指数replication index,RI
使用细胞松弛素B时计算细胞毒性的方法。染毒期和恢复期中处理组相对于对照组完成分裂周期的细胞比例。
3.9
相对细胞增长数relative increase in cell count,RICC
不使用细胞松弛素B时计算细胞毒性的方法。
3.10
相对集落倍增relative population doubling,RPD
不使用细胞松弛素B时计算细胞毒性的方法。
3.11
增殖指数proliferation index,PI
不使用细胞松弛素B时计算细胞毒性的方法。
4试验原理
体外微核（in vitro micronucleus,MNvit）试验是用以检测细胞分裂间期细胞质中微核（MN）的一种遗传毒性检测方法。这些微核可由无着丝粒染体断片（例如缺乏着丝点的染体片段），或是那些在细胞分裂后期无法迁移到两极的整条染体形成。该方法通过检测暴露于受试物期间或之后进行过分裂的细胞的微核形成率，来反映受试物导致染体断裂和非整倍体的损伤作用。
转向节本方法既适用于使用肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素B（cytochalasin B,cytoB）的方案，也适用于不使用细胞松弛素B的方案。在细胞进行有丝分裂前添加cytoB，可以帮助识别只进行了一次有丝分裂的细胞（因为此时该细胞为双核细胞），并且有选择性地分析这些双核细胞的微核率。如果有证据表明所分析的细胞增殖已经历了有丝分裂，则允许不使用cytoB的方案。
5试验方法及步骤
5.1准备
5.1.1细胞
常用中国仓鼠肺细胞株（V79、CHL）、中国仓鼠卵巢细胞株（CHO）、小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y）和人淋巴母细胞（TK6）等。对于已建立的细胞系或细胞株应进行核型和支原体污染的常规检查。5.1.2培养液及培养条件
应根据实验所用系统和细胞类型来选择适宜的培养液和培养条件（培养瓶/皿、CO2浓度、温度和湿度）。 5.1.3代谢活化
通常使用的外源性代谢活化系统是S9混合物。其中S9是以酶诱导剂（Aroclor1254或与β-萘黄酮联合使用）处理的啮齿类动物肝脏获得的。S9组分在培养液中使用的浓度范围通常为1%-10%（V/V）。
5.1.4胞质分裂阻滞剂
各实验室应考察所用细胞系的cytoB适合浓度，以得到最佳的溶剂对照组双核细胞率。cytoB的浓度通常为3-6μg/ml。
5.2对照
每次试验，在有/无代谢活化系统条件下均应设置阳性对照和阴性（溶剂）对照。
5.2.1阳性对照
当需要代谢活化系统时，染体断裂剂阳性对照物可以选用环磷酰胺、苯并(α)芘，染体断裂剂阳性对照物可以选用丝裂霉素C、甲磺酸甲酯、阿糖胞苷、4-硝基氮氧化喹啉；非整倍体诱发剂阳性对照物可以选用秋水仙素、长春碱，目前尚未发现需要代谢活化才能产生毒性的非整倍体诱发剂。
如实验室在半年内进行过阳性物试验，且在本试验中得到正确的结果，则不要求必须在每次试验中进行阳性对照物试验。
5.2.2阴性对照
每个收获时间点都应设置阴性（溶剂）对照。阴性（溶剂）对照除不含受试物外，其他处理应与受试物组相同。此外，当不具有实验室历史资料证实所用溶剂无遗传毒性和无其他有害作用时，还应设置空白对照。
5.3受试物
5.3.1溶剂的选择
所选溶剂不应与受试物发生化学反应，并且在所用浓度下对细胞存活率和S 9活性均无影响。常用溶剂包括水、水性溶剂（如氯化钠、细胞培养液）、二甲基亚砜（DMSO ，终浓度不应大于0.5%）等。
5.3.2受试物的配制
考虑到日用化学品的特殊性，其取样过程应尽可能顾及样品的代表性和均匀性，以便分析结果能正确反映其产品质量。在取样品前，应目测样品的性能和特征，并使样品彻底混匀。受试物应在实验前新鲜配制，否则就必须证实贮存不影响其稳定性。样品为粉末、颗粒、膏状、片剂等固体受试物时，应先研磨成细粉状，再溶于或悬浮于适当的溶剂中，用前稀释至适合浓度。样品为液体受试物时，可直接加入试验系统和/或用前稀释至适合浓度。样品为气体或挥发性受试物时，应根据标准试验方案进行适当调整，如在密闭的培养器皿中进行暴露处理等。
5.4剂量设计
5.4.1细胞增殖和细胞毒性的测定
检测细胞增殖情况是为了确保经处理的细胞在试验过程中已经完成了有丝分裂，而且染毒浓度可引起适当的细胞毒性。细胞毒性应在有/无代谢活化系统条件下均使用指示细胞完整性和生长情况的指标进行评价确定。
5.4.1.1如果使用cytoB ，可以通过检测培养物中单核细胞、双核细胞和多核细胞的相对个数，为评价经处理后对细胞增殖、细胞毒性的影响作精确的定量计算，并且可以确保只有在处理时或处理后进行了有丝分裂的细胞才能被计数。可以采用胞质分裂阻断增殖指数（CBPI ）或复制指数（RI ）来反映细胞增殖情况。
天然气调压撬细胞总数
多核细胞数
双核细胞数单核细胞数⨯+⨯+=32CBPI 其中，CBPI 等于1（即所有细胞都是单核细胞）时，相当于100%细胞生长抑制；细胞总数应计数每份培养物至少500个细胞。
1001
CBPI 1-CBPI -C T ⨯-=100细胞毒性%其中，CBPI T 为受试物处理组的增殖指数，CBPI C 为阴性对照组的增殖指数。
100⨯⨯+⨯+=C
T 数多核细胞数）/细胞总2（双核细胞数数多核细胞数）/细胞总2（双核细胞数RI 其中，T=受试物处理组，C=阴性对照组；细胞总数应计数每份培养物至少500个细胞。
%细胞毒性=100-RI
5.4.1.2如果不使用cytoB ，就必须证明所计数的细胞在处理时或处理后已经经历了有丝分裂，否则可能会出现假阴性结果。可以采用溴脱氧尿苷（BrdU ）对永生化细胞系进行细胞增殖原位标记得出增殖指数（PI ）或者依据相对细胞增长数（RICC ）、相对集落倍增（RPD ）来反映细胞增殖情况。cl8
cl4cl2cl1cl8
4cl43cl22cl11PI +++⨯+⨯+⨯+⨯=其中，cl1：1个细胞的细胞集落数，cl2：2个细胞的细胞集落数，cl4：3-4个细胞的细胞集落数，cl8：5-8个细胞的细胞集落数
100试验前后加阴性对照组细胞数的增试验前）试验后处理组细胞数的增加（受RICC ⨯--=）
（试验试物100数
阴性对照组细胞集落处理组细胞集落倍增数受RPD ⨯=倍增试物其中，()[]2
log //log 试验前细胞数试验后细胞数细胞集落倍增=%细胞毒性=100-RICC （或RPD ）
5.4.2最高浓度的选择
决定受试物最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH 值、渗透压的改变。每次试验至少应设置3个可供分析的浓度。通常所选定的分析浓度间距应不超过10。当有细胞毒性时，最高浓度应能产生55±5%的细胞毒性（更高水平的浓度可能因细胞毒性的继发作用而引起染体损伤），其浓度范围应包括从55±5%的细胞毒性到几乎无细胞毒性。如果相对无细胞毒性，也不产生沉淀，则最高浓度可选取0.01mol/L 、2mg/ml 或者2µl/ml ；但如果受试物是未知化学物时，最高浓度可以设置得更高为5mg/ml 。对于表现出陡峭剂量-反应曲线的受试物，应缩小受试物浓度间距，以便在中等和低毒性范围的培养也能被检测出。对于相对不溶解的物质，当浓度低于不溶解浓度时仍无毒性时，那么最高浓度应是能引起最小可见沉淀的最低浓度，但沉淀不应影响观察，最好在试验处理开始和结束时均评价溶解度，因为由于S 9等的存在，试验系统内在暴露过程中溶解度可能发生变化。
5.5试验步骤
5.5.1处理程序
在有/无代谢活化系统条件下，将受试物短时间4h 处理细胞，去除受试物，PBS 洗两次，加入新的培养液，同时可以选择添加或不添加cytoB ，继续使细胞经过1.5-2.0个正常细胞周期后收获细胞，就可以检测出大部分的非整倍体诱发剂和染体断裂剂。若短期处理4h 的初期试验结果为阴性或不明确，应继续进行无代谢活化系统条件下的延长处理（1.5-2.0个正常细胞周期）试验。以下表1为推荐的细
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