任静;蒋学华;邓盛齐;陶静
【摘 要】目的 评价绿原酸大鼠口服吸收的绝对生物利用度.方法 以绿原酸大鼠静脉注射给药后药动学参数AUC为参照,三组大鼠按照200、400、600mg/kg给药剂量分别灌胃给药,计算相关参数,按公式Fpo(％)=AUCpo×Div/(AUCiv×Dpo)×100％计算绝对生物利用度.结果 静脉注射给药后AUC0→t为198.01±42.36mg/L·min.灌胃200、400、600mg/kg三个剂量下的AUC0→t分别为339.39±16.03、1268.31±207.08和2530.35±442.57mg/L·min,绝对生物利用度分别为34.28％、64.06％和85.2％.结论 绝对生物利用度的评价为绿原酸制剂开发提供了有益参考.%Objective To evaluate the absolute bioavailability of chlorogenic acid by intragastric administration in rats. Methods Chlorogenic acid was administrated by oral at doses of 200, 400 and 600mg/kg. Pharmacokinetic parameters were then calculated. Based on the pharmacokinetic parameter AUC by intravenous injection, absolute bioavailability was calculated as follow, Fpo=AUCpo× Div/ (A UCiv ×Dpo)×1 00%. Results AUC0→t of intravenous injection was 198.01±42.36mg/L·min. After intragastric administration, AUC0→t
of 200, 400 and 600mg/kg group was 339.39±16.03, 1268.31±207.08 and (2530.35±442.57)mg/L·min, respectively. The absolute bioavailability of this three group was 34.28%, 64.06% and 85.2%, respectively. Conclusion The evaluation of the absolute bioavailability provides a useful reference for the development of preparation of Chlorogenic acid.
【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2012(037)011
【总页数】4页(P847-850)
【关键词】重油燃烧器绿原酸;大鼠;口服吸收;绝对生物利用度
【作 者】任静;蒋学华;邓盛齐;陶静
【作者单位】中国医药集团总公司四川抗菌素工业研究所,成都 610052;四川大学华西药学院,成都 610041;中国医药集团总公司四川抗菌素工业研究所,成都 610052;中国医药集团总公司四川抗菌素工业研究所,成都 610052
【正文语种】中 文
【中图分类】疏花水柏枝R969.1
绿原酸(chlorogenic acid，ChA)是咖啡酸(caffeic acid，CA)与奎尼酸(鸡纳酸，quinic acid，QA)缩合而成的酯，是许多植物中发现的多酚类化合物之一。绿原酸具有抑制肝脏葡萄糖-6-磷酸酶，抑制氧化和酯质过氧化反应等[1]多种药理活性，临床应用广泛。绿原酸药理活性的发挥与其体内过程密不可分，已有的药动学研究表明，绿原酸在体内转运表现出线性动力学过程[2]，但是表征吸收程度的绝对生物利用度还未见报道。本文以大鼠为实验动物，评价了3个剂量下绿原酸在大鼠体内的口服吸收绝对生物利用度，以期为进一步的制剂开发奠定生物药剂学基础。
1 仪器、试药与动物
哑光玻璃Lab Alliance高效液相谱仪、紫外检测器、泵及柱温箱(美国SSI)；AnaStar谱工作站(日本Shimdazu)； CP225D电子天平(德国Sartorius)；VORTEX GENIUS 3型混旋仪(德国IKA公司)；TGL-16台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。
绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，纯度≥98%，批号110753-200613)；金银花提取物(含99.8%绿原酸，成都晨光化工研究院)；甲醇、乙腈为谱纯；水为超纯水；其它试剂和试药均为分析纯。
大鼠静脉注射供试液：取含99.8%ChA的金银花提取物适量，精密称定，加入5mL生理盐水溶解，混匀，得浓度为4mg/mL的静脉注射液。
动物：Wistar大鼠，体重200±20g，雌雄各半(四川大学实验动物中心提供)。
2 方法与结果
2.1 溶液的配制
取绿原酸对照品约26mg，精密称定，置25 ml棕量瓶中，甲醇溶解，稀释定容至刻度，摇匀即得浓度为1052μg/mL的ChA对照品贮备液，4℃冷藏保存。取葛根素约25mg，精密称定，置25mL棕量瓶中，甲醇溶解，稀释定容至刻度，摇匀即得浓度为1000μg/mL的内标贮备液，4℃冷藏保存。临用前用甲醇稀释10倍即得内标溶液。 精密量取血浆样品0.1mL，加入内标溶液(100μg/mL)20μL，甲醇与0.2%磷酸混合液(20: 80，V/V)20μL，10%三溶液0.1mL，旋涡混匀2min，置离心机中，12000r/min离心10min，精密量取上清液20μL进样分析。
2.3 谱条件与方法
2.3.1 谱条件
番茄加速
谱柱为Scienhome Kromasil C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈-甲醇-pH3.0磷酸盐缓冲液(20:15:170，V/V/V)；流速为1.0mL/min；检测波长为322nm；柱温为25℃；进样量为20μL。在上述谱条件下，测得空白血浆、ChA+内标+空白血浆、血浆样品的谱图见图1。由图1可见，ChA和内标保留时间分别约为7.5min、11.0min，血浆中其它物质不干扰内标与ChA的测定。
2.3.2 标准曲线制备
精密量取ChA对照品贮备液适量，分别用甲醇-0.2%磷酸混合液(20: 80，V/V)稀释成系列浓度的ChA对照品工作液，各取20μL加入0.1mL空白血浆中，得到浓度分别为0.210、0.42
1、1.052、2.104、6.312、10.520、21.040和42.080μg/mL的含药血浆，加入内标溶液20μL，按“2.2血浆样品预处理”方法，依法测定，记录谱图、内标物峰面积(Ai )、ChA峰面积(As)。计算药物峰面积与内标物峰面积的比值Y(As/Ai)，以Y作为纵坐标，血浆中ChA浓度C(μg/mL)为横坐标，进行加权回归，得到ChA的标准曲线方程为Y=0.1902C-0.0156，r＝0.9999，权重为1/C2。在0.210～42.080μg/mL浓度范围内，ChA与内标物峰面积比值与ChA浓度有良好的线性关系。检测限为0.053μg/mL。
2.3.3 方法回收率试验
FANPN精密量取ChA对照品溶液，各取20μL加入0.1mL空白血浆，配制高、中、低3个浓度的已知浓度样品，按标准曲线方法，从“加入内标溶液20μL”开始操作，以测得值与加入量的比值计算回收率，结果见表1。ChA高、中、低浓度的回收率分别为96.6%、100.0%、102.7%。
2.3.4 提取回收率试验
精密量取ChA对照品溶液，各取20μL加入0.1mL空白血浆，配制高、中、低3个浓度的已知
浓度样品，按标准曲线方法，从“加入内标溶液20μL”开始操作，记录峰面积；另取相同浓度，以水代替空白血浆，按标准曲线方法，从“加入内标溶液20μL”开始操作，记录峰面积。以前后两种处理测定得到的ChA峰面积之比和内标物峰面积之比分别计算待测物和内标物的提取回收率，结果见表2。
表1 方法回收率实验结果(n=6)Tab.1 Results of recovery test (n=6)
表2 提取回收率试验结果(n=6)Tab.2 Results of extract recovery test (n=6)
2.3.5 精密度试验
按方法回收率试验项下方法，测定ChA高、中、低3个浓度已知浓度样品溶液，以一天内6次测定结果计算批内精密度，一周内3d测定结果计算批间精密度。结果表明，批内相对标准差分别为2.00%、2.73%、3.97%，批间相对标准差分别为2.53%、3.49%、8.66%。
2.3.6 待测物大鼠血浆中稳定性考察
参照SFDA“化学药物非临床药代动力学研究技术”与FDA的“Guidance for Industry－Bioanal
ytical Method Validation”中的相关技术指导原则，并结合待测物本身理化性质及预试验结果，样品的稳定性考察包括(a) 样品于室温下放置3h的稳定性考察；(b) 样品反复冻融三次的稳定性考察；(c) 样品的长期稳定性考察(-20℃)。结果表明样品于室温下放置至少3h内可保持稳定，于-20℃条件下放置至少3d内可保持稳定，样品经过3次冻融后可保持稳定。弹簧绳
2.4 大鼠口服吸收绝对生物利用度评价
以ChA大鼠静脉注射给药后药动学参数AUC为基础，评价口服3个剂量下ChA的绝对生物利用度。
ChA大鼠静脉注射试验方法：选取健康Wistar大鼠5只，空腹过夜(自由饮水)，按照40mg/kg尾静脉注射供试液，注射时间平均控制在30s以内。给药前采集空白血浆约0.3～0.4mL，给药后于5、10、20、30、40、60、80、100、120、150min断尾取血约0.3～0.4mL，置0.5mL肝素化塑料离心管中，离心后分离血浆，所得血浆置-20℃保存待测。
ChA大鼠灌胃给药试验方法：选取健康Wistar大鼠15只，空腹过夜(自由饮水)，次日随机分成3组。试验开始前，大鼠腹腔注射钠麻醉(35mg/kg)，暴露左侧颈静脉，以接三
通的PE管插管后，通过三通推注给予肝素钠溶液(700U/kg)抗凝。动物清醒后灌胃给药前先于三通处采集空白血0.3～0.4mL。3组大鼠按照低(200mg/kg)、中(400mg/kg)、高(600mg/kg)给药剂量分别灌胃给药。给药后于2、5、10、15、20、30、45、60、90、120、240、360、480、720 min颈静脉采血约0.3mL，置0.5mL肝素化塑料离心管中，离心后分离血浆，所得血浆置-20℃保存待测。
药动学参数通过下列标准方法计算：Cmax、Tmax由药时曲线数据直接读取，AUC以梯形法计算。按下式计算ChA三个口服剂量的绝对生物利用度：
大鼠静脉注射(40mg/kg)及灌胃给予3个剂量的ChA后的血浆ChA浓度经时曲线分别见图2～3。涉及绝对生物利用度计算的药动学参数及计算结果见表3。口服ChA 200、400、600mg/kg后，绝对生物利用度分别为34.28%、64.06%、85.20%。
表3 绿原酸绝对生物利用度结果(n=5)Tab.3 Results of absolute bioavailability of ChA in rats (n=5)
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