聂雪凌;唐鸿志;许平
【摘 要】绿原酸具有抗菌、抗病毒、清除自由基和兴奋中枢神经系统等多种生物活性,是“第七类营养素”-多酚的主要成员之一.但目前对绿原酸的代谢药理活性机理的研究还不够深入.研究绿原酸的代谢途径对提高其生物活性的利用率及其经济价值的深度挖掘具有重要意义.本文结合近年来有关绿原酸的研究报告,归纳总结了绿原酸的检测方法及代谢途径,为提高绿原酸价值的研究及其在工业生产中的应用提供参考. 【期刊名称】《广州化工》
【年(卷),期】2013(041)001
【总页数】4页(P3-6)
【关键词】绿原酸;检测方法;代谢途径
【作 者】聂雪凌;唐鸿志;许平
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【作者单位】上海交通大学微生物代谢国家重点实验室,生命科学技术学院,上海200240;上海交通大学微生物代谢国家重点实验室,生命科学技术学院,上海200240;上海交通大学微生物代谢国家重点实验室,生命科学技术学院,上海200240
【正文语种】中 文
【中图分类】Q936
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绿原酸 (Chlorogenic acid)是由咖啡酸与喹尼酸生成的缩酚酸，是植物在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物，广泛存在于水果、蔬菜及大部分饮料中，是人们日常摄入多酚的主要成分之一。由于绿原酸具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等多种生物活性，很早就引起了科学界的关注。早在1957年，《Nature》期刊上就有了关于绿原酸在苹果汁发酵中的代谢的研究［1］。现阶段大多数研究主要集中于绿原酸的营养学研究，通过注射及食用绿原酸，研究其在生物体内的吸收及分解代谢，并推测出代谢途径。随着对绿原酸的深入研究，绿原酸的应用价值也越来越被深度开发。卫生部《药品标准》中收录了近170种以绿原酸为主要成分的中成药，其中有很多是以绿原酸为质量控制的重要标志之一［2］。绿原
酸也是保健药品的重要添加剂之一，以其为代表的多酚类物质已被人们称为“第七类营养素”。在食品行业中，绿原酸可取代人工合成的抗氧化剂，用于食品及水果的保鲜。在日用化工行业，绿原酸用作化妆品抗氧化添加剂，可保护胶原蛋白不受活性氧等自由基的破坏并能有效防止紫外线对人体皮肤的伤害。目前欧洲已有多项关于此类产品的专利［3］。近年来，随着绿原酸在工业中的广泛应用，绿原酸的检测方法也受到了人们的高度重视。绿原酸的检测方法的深入研究，加速了绿原酸的科研进程及工业应用。绿原酸代谢途径的研究，可为进一步阐明绿原酸在生物体内的药理作用，提高绿原酸的生物活性的利用率及食品安全性具有重要意义。本文通过查阅国内外相关文献，对绿原酸的检测方法及代谢途径进行了归纳总结，以期为绿原酸的研究与开发及其在工业生产中的应用提供参考。 1 绿原酸的检测方法
1.1 分光光度检测法
分光光度检测法包含紫外分光光度法和可见分光光度法。紫外分光光度法是利用绿原酸在330 nm处有特征吸收峰且其吸光度与绿原酸的浓度在一定范围内呈良好的线性关系，而进行绿原酸含量的检测。可见分光光度法是根据绿原酸类物质在碱性条件下能与金属离子发
生络合显反应，并产生特征吸收光谱的原理来测定绿原酸的含量。袁华等利用绿原酸与铝离子在碱性条件下能形成稳定的紫红络合物，采用可见分光光度法在波长530 nm处测定杜仲叶中的绿原酸含量［4］。具体操作过程为:量取一定体积的绿原酸标准溶液于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL 5%的NaNO2，和0.5 mL 10% 的Al(NO3)3，静止5 min，再加入1 mol/L的NaOH溶液2 mL，然后用体积分数95%的乙醇定容，以95%的乙醇作为空白对照，在530 nm处测定吸光度。通过实验发现，绿原酸质量浓度在1.7×10－4～1.0×10－2g/L之间线性关系良好。也有研究者利用绿原酸与铁离子能形成绿络合物，在755 nm处检测以绿原酸为主的植物中多酚的含量［5］。
分光光度法操作简便，对仪器要求低，但很容易受其它结构类似物的干扰，检测结果不够准确，只适合于一些常规性绿原酸含量的检测。
1.2 薄层层析－紫外分光光度检测法
随着薄层层析技术的发展，人们开始利用一定配比的展开剂先使样品中的绿原酸与干扰物质完全分离，然后通过显剂显，再结合紫外分光光度检测法进行绿原酸的定量检测。一般是先在硅胶板上点样，采用一定的展开剂展开，在紫外灯下刮取斑点，经甲醇或乙醇
食品安全检测试纸
溶解，然后通过紫外分光光度计检测330 nm处的吸光值。常用的展层剂的配比为:乙酸乙酯∶甲酸∶水∶乙醇 (5∶5∶4∶1，V/V);乙酸乙酯∶甲酸∶乙酸∶水(100∶11∶11∶27，V/V);乙酸丁酯∶乙酸∶水 (10∶2∶3，V/V);醋酸丁酯∶甲酸∶水 (7∶2.5∶2.5，V/V)。金蓉鸾等利用双波长薄层层析扫描仪直接在薄层板上对绿原酸和异绿原酸进行含量的测定，结果稳定［6］。此方法能有效消除杂质对绿原酸的干扰，结果准确且仪器常备，适合绿原酸常规性检测。
1.3 高效液相谱检测法
高效液相谱法由于其分离效果显著、线性关系好、检测极限低、回收率与精密度高、以及重复性好等优点，是目前绿原酸检测中最常用的分析方法。由于绿原酸在碱性条件下易发生水解，以及自身的极性，从而导致图谱拖尾严重，影响测定结果的准确性。因此在实际操作中，都会在流动相里添加一定比例的酸类物质 (乙酸，甲酸或磷酸)，可有效抑制酚羟基解离，改善峰型［7］。在用高效液相谱法检测绿原酸含量时，可根据样品特点及实验要求，选择适当的流动相配比及洗脱方法(等速洗脱或梯度洗脱)。 等速洗脱法方便，快速，但分离效果差，需定期使用不同极性的流动相冲洗谱柱，以保
证实验的准确性，只适合检测成分相对简单的样品中的绿原酸。甄攀等用高效液相谱等速洗脱法，同时分析了茶叶中的绿原酸和，绿原酸的保留时间为4.7 min，为茶叶中绿原酸的检测提供了一个操作方便，稳定，准确，快速的分析方法［8］。其中谱条件为:C18谱柱(ODS 20 cm ×4.6 mm);流动相:甲醇－1%冰醋酸 (32∶68，V/V);流量:1.0 mL/min;柱温:室温;SPD－6AV紫外检测器;C－R3A数据处理仪。熊杰等也通过流动相的选择优化，确立了以乙腈－水－甲酸 (23∶230∶1.2，V/V)为流动相等速洗脱的RP－HPLC法检测绿原酸的含量［9］。也有文献报到以甲醇－0.05%磷酸水溶液 (30∶70，V/V)为流动相检测绿原酸含量的RP－HPLC法［10］。
梯度洗脱法能有效改善等速洗脱的分离效果差，容易损伤柱子的问题，是绿原酸高效液相谱检测中最常用的方法。烟草中多酚的国家标准检测法就是以水∶甲醇∶乙酸 (88∶10∶2，V/V)为流动相A;以水∶甲醇∶乙酸 (10∶88∶2，V/V)为流动相B，进行梯度洗脱，40 min可将烟草中包括绿原酸在内的三种多酚物质分离开［11］。也有文献报道以乙腈为流动相A，水－冰醋酸 (99∶1，V/V，pH=2.8)为流动相B，测定药物栓剂中的绿原酸，分析周期仅为30 min。
由于一般样品中化合物成分复杂，有很多物质的最大吸收波长与绿原酸不一致，从而出现了高效液相谱－蒸发光散射检测法。库尔班江等采用 C18谱柱，以乙腈为流动相 A，0.5%冰醋酸为流动相B，进行梯度洗脱，以蒸发光散射检测器检测金银花中的绿原酸及其它成分［12］。其中梯度洗脱程序为:0 min(A:10%，B:90%);16 min(A:25%，B:75%);22 min(A:50%，B:50%)，流速1.0 mL/min;检测器漂移管温度110℃，载气流速3.0 mL/min。该方法可避免溶剂信号对样品的干扰，在流动相组分发生较大梯度变化的阶段仍能保持基线的稳定，从而缩短的分析时间。但此方法的灵敏度比UV检测法低约一个数量级，需加大样品浓度来克服此缺点。
1.4 气相谱检测法
气相谱是一种以气体为流动相的柱谱法，气化的样品经载气带入谱柱中进行分离，分离后的各组分随着载气先后流入检测器，然后载气放空。检测器将物质的浓度或质量的变化转变为一定的电信号，经放大后在记录仪上记录下来，就得到谱流出曲线。根据谱流出曲线上得到的每个峰的保留时间，可以进行定性分析，根据峰面积或峰高的大小，可以进行定量分析。气相谱法在绿原酸结构类似物的检测中应用广泛，但绿原酸类化合
梭子鱼综合症>参红祛瘀散结胶囊物的气化温度高，需要进行繁琐的衍生过程后才能检测。通过实验摸索方便快捷的衍生方法，是利用气相谱法检测绿原酸急需解决的问题。
别立洁等［13］通过以正己烷及甲醇水溶液为萃取剂依次对烟草进行萃取，将萃取物烷基化后进行气相谱分析，并对其中的绿原酸进行了定量检测。样品处理为:25 μL萃取液减压干燥后加入50 μL三甲硅烷基化试剂，密封后放入烘箱内，100℃下加热1 h使其酯化。检测器的条件为:谱柱:HP－5毛细管柱 (Crosslinked 5%pH ME Siloxane，30 m);检测器:FID;升温程序:180℃ (保持2 min)，5℃/min升温到250℃。保留时间为12.4 min左右。此方法灵敏度高，重现性好，但酯化温度太高。
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