宋宇
【摘 要】为制定草莓的适时施肥计划提供理论依据,采用Illumina高通量测序平台对草莓不同生长时期土壤微生物的落进行16SrRNA基因(V3-V5区)高通量测序,检测4个草莓不同生长时期的土壤微生物落结构和丰度.结果表明:测序共获得有效序列数364 968条,OTU数38 124个,归属为10门(Proteobacteria,Acidobacteria,Chloroflexi,Actinobacteria,\r\nSaccharibacteria,Thaumarchaeota,Bacteroidetes,WD272,\r\nGemmatimonadetes,Nitrospirae)和其他未分类的单元;结果期土壤微生物落的丰度值最大,特有的微生物种类也最多;优势微生物菌为变形菌门(Proteobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria),生长期和结果期的优势属均为(Candidatus Solibacter),开花期和盛果期的优势属为副球菌属(Rhizomicrobium).
【期刊名称】《贵州农业科学》
【年(卷),期】2018(046)008
【总页数】4页(P59-62)
【关键词】草莓;生长时期;土壤;微生物落;高通量测序
交通事故现场图绘制
【作 者】宋宇
【作者单位】辽东学院城市建设学院,辽宁丹东118003
【正文语种】中 文
【中图分类】S668.4
土壤微生物是生态系统的重要组成部分，是土壤养分和有机质转化与循环的重要动力，在陆地生态系统中发挥至关重要的作用[1-2]。土壤微生物在各方面影响着植物的生长发育，其落的组成与活性也与植物生产力有关。近年来，土壤微生物落组成与多样性研究成为国际土壤微生物学、土壤生态学及全球变化生物学等领域研究的热点之一[3-5]。传统的平板分离培养已不能很好地反映土壤中微生物类的真实情况。因此，将经典的平板培养技术和现代分子生物学PCR产物的变性梯度凝胶电泳技术相结合，极大地推动了根际微生物的研究，对根际微生物在各领域的应用发挥了极其关键的作用[6-7]。但由于PCR扩增受引物特异性、DNA提取条件以及微生物落结构复杂等因素的影响，难以全面剖析生境中
微生物的落结构。近年来，高通量测序(High-throughput sequencing)技术为土壤微生物落结构分析开辟了新的途径。基于此，笔者等利用高通量测序技术分析草莓不同生长时期土壤微生物落结构变化，了解草莓不同生长时期土壤微生物落结构，为草莓制定适时的施肥计划提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器设备
TaqDNA polymerase(TaqDNA聚合酶)、dNTPs(高质量的脱氧核糖核苷酸)和DL 2000TM DNAMarker(DL2000TM DNA标记)均购于大连宝生物公司，蛋白酶 K(Merck)、溶菌酶(Sigma)、琼脂糖、丙烯酰胺、N，N′-亚甲基双丙烯酰胺和去离子甲酰胺均购于 Solar公司，Quick Gel Extraction Kit、MIBIO Ultra Clean Donaldson Isolation Kit和Acquaintanceship定量试剂盒均购于美国 MD Spectra Drop公司；核酸蛋白微量检测仪购于美国 MD Spectra Drop公司，引物由北京美因生物公司合成；高通量测序仪购于美国 Roche GS junior公司，PCR仪购于美国Bio-radC 1000 Touch公司，高速冷冻离心机购于德国Peppercorn 5430公司，水平电泳仪购于美国 Bio-rad Mini-sub cell公司，凝胶成像分
析系统购于美国 Bio-rad Biochemists公司，EX-S型可调式混匀仪购于美国 SCILOGEX公司。
1.2 土样采集
土壤样品采于辽宁东港椅圈镇某草莓种植基地。于草莓的生长期、开花期、结果期和盛果期的晴天上午采集土样。每处土样采用S型5点取样法，拨开根系周围的表土层，采集离根系最近的土壤，取样深度为0～10 cm,采集的新鲜土壤混匀后装于无菌塑料袋内带回实验室于-20℃保存。
1.3 土样总DNA提取及高通量测序
采用 E．Z．N．A．Soil DNA Kit(Omega Bio-eek，Crosstown，GA，U．S．)提取土壤总 DNA，利用 1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组 DNA，用核酸蛋白仪检测DNA的浓度和纯度；对16sRNA基因的V3～V5可变区片段进行PCR扩增，最终得到的序列用于OTU分析；利用USEARCH方法进行序列聚类(序列相似性设为97%)，将序列相似性达97%的序列聚类为一个OTU，统计各样品在不同OTU的丰度信息，用贝斯特算法[8]对OTU的代表性序
列进行物种分类学分析。基于OTU的分析结果，对样本序列进行随机抽样，分别计算chao1,Shannon, Simpson等α多样性指数并基于weighted uniform 样本间距离矩阵用于PCOA(principal co-ordinates analysis)图展示β多样性等。
2 结果与分析
2.1 高通量测序数据及OUT量
从表1看出，测得原始序列数是381 563条，质控序列数是368 988条，有效序列数是364 968条，草莓4个不同生长时期的样品共产生38 124个OTU，其中，盛果期的OTU最多，为10 160个，生长期的OTU最少，为8 606个。从图1看出，4个样本共有的OTU数目为6 385个，生长期、开花期、结果期、盛果期特有的OTU数目分别为877个、1 181个、1 508个和1 378个，其余OTU为样本两两共有。其中，结果期中特有的OTU数目最多，预示着较多的特有微生物种类；开花期和盛果期共有的OTU数目最多，为11 280个。
表1 草莓各生长期土壤微生物的高通量测序数据及OUT量Table 1 High-throughput sequencing data and OTU quantity of soil microbes at different growth stages of strawber
旅游电商平台ry生育期Growth period原始序列数(条)Original sequence number质控序列数(条)Quality control sequence number有效序列数(条)Effective sequence numberOTU数量(个)OTU quantity生长期 Growth stage87 93084 85984 1118 606开花期 Flowering stage94 88991 79990 5539 435结果期Fruit-bearing stage94 86491 82890 8609 923盛果期 Full bearing stage103 880100 50299 44410 160合计 Total381563368 988364 96838 124
图1 各样品(组)的共有OTU数目(个)
Fig.1 OTU quantity of different samples
2.2 草莓不同生长期土壤的优势菌落结构
2.2.1 门水平 从图2看出，4组土壤样品落结构在门分类水平上具有较高的多样性，均达到10个门以上。主要包括变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)，放线菌门(Actinobacteria)、奇古菌门(Thaumarchaeota)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、螺旋体门(Saccharibacteria)，WD272、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)和其他菌门。
图2 门水平草莓不同生长时期土壤微生物的落结构及分布
Fig.2 Structure and distribution of soil microbial community at phylum level at different growth stages of strawberry
其中，变形菌门相对丰度最高，占58.25%，其次为酸杆菌门，占33.1%。生长期变形菌门和放线菌门占优势，结果期酸杆菌门占优势，盛果期绿弯菌门占优势。螺旋体门则在生长期、开花期和盛果期占优势，在结果期则明显占劣势。
2.2.2 属水平 从图3看出，Candidatus Solibacter,副球菌属 (Rhizomicrobium, Bryobacter)在草莓的4个生长时期占有绝对优势，分别占5.86%，115.71%和12.99%。而在生长期亚硝化细杆菌属(Candidatus Nitrosotalea)和Aquicella相对丰度较其余3个时期小，而伯克氏菌属(Burkholderia)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)的相对丰度则比其余3个时期大。
图3 草莓不同生长时期土壤微生物属水平的落结构及分布
Fig.3 Structure and distribution of soil microbial community at genus level at different growth stages of strawberry
it运维系统详细设计
2.3 微生物落多样性
激光发射器2.3.1 α多样性 从图4看出，生长期 chao1值偏低，开花期和结果期相近，盛果期略低，说明生长期土壤微生物的物种总数最少，随着草莓开花期、结果期的到来，物种变得越来越丰富。草莓各生长时期的Shannon指数相近，说明各时期土壤微生物的落多样性相近。
编织软管
headcall图4 草莓各生长时期chao1指数和Shannon指数
Fig.4 Chao1 index and Shannon index of strawberry at different growth stages of strawberry
2.3.2 β多样性 落生态学中，β多样性主要描述物种组成在时空尺度上的变化。从图5看出，主成分1 (PC1)和主成分2 (PC2)分别在样品差异性贡献率上达50.43%和23.57%，合计达74%，是差异的主要来源。PCA分析样品开花期和盛果期距离最近，均位于PC2 的负值区域，说明两样品间的主成分变异不显著；而生长期位于PC2 的正值区域且位于PC1的负值区域，说明该时期的微生物落和其余时期的落有一定差异。
图5 草莓不同生长时期微生物落的主成分分析结果
Fig.5 PCA analysis of soil microbial community at different growth stages of strawberry
3 结论与讨论
目前，人类已经发现的纯培养微生物还不到自然界微生物总量的 1%[9]，所以，仅利用传统的分离技术揭示样品中的微生物组成几乎不可能。1998年提出宏基因组学[10]，随后高通量测序技术的出现则使得全貌解析环境微生物成为可能[11]。近年来，高通量测序技术广泛应用于水环境、陆地、肠道、动植物等环境微生物检测[12-18]，而且在环境监测、生产管理和生态评估等方面发挥着重要意义[19-20]。研究结果发现，草莓不同生长时期土壤微生物落可归属为10门(Proteobacteria, Acidobacteria, Chloroflexi, Actinobacteria, Saccharibacteria, Thaumarchaeota, Bacteroidetes, WD272, Gemmatimonadetes, Nitrospirae)和其他未分类的单元，优势菌为变形菌门(Proteobacteria)主要包括A-OK变形菌纲(Alpha proteobacteria 35.03%)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria 8.6%)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria14.61%)其次为酸杆菌门(Acidobacteria)。生长期和结果期的优势属均为Candidatus Solibacter,开花期和盛果期的优势属为副球菌属(Rhizomicrobium)。Candidatus Solibacter是分解有机质、利用碳源的细菌,与土壤有机质含量呈正相关关系[21]
。说明在生长期和结果期有机质含量需求大。结果期中特有的OTU数目最多，说明有较多的特有微生物种类。α多样性分析结果显示，SZ期物种总数最少，随着草莓开花，结果期的到来，物种变得丰富。β多样性分析结果显示，生长期与其余3个时期的微生物落差异显著。该研究结果可为草莓适时施肥提供理论依据。
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