“微⽣物组”（Microbiome）是指由多种微⽣物聚居在⼀起形成的⽣态落，从⼈和动物的肠道，到植物、⼟壤、海洋，它们⽆处不在，推动着地球物质循环，影响着⼈体乃⾄整个地球⽣物圈的健康。
近年来，得益于低成本⾼通量基因测序技术的发展、计算和成像技术的改进，以及⽤于数据分析的⽣物信息学⼯具的⾰新等进展，⾼通量测序⾛下神坛，变得平易近⼈，使得更多的学科领域开始投⼊到微⽣物组学的研究中来。 对于微⽣物组学的研究，最常见的就是对微⽣物落结构多样性的研究。也就是通过⼆代测序技术对16S rDNA/18S rDNA/ITS等序列进⾏测序，获得样品中的微⽣物落组成以及相对丰度。探讨微⽣物多样性对于研究微⽣物与环境的关系、环境治理和微⽣物资源的利⽤有着重要的理论和现实意义。 那么问题来了
你真正了解16S测序吗？
为什么选择16S测序？
16S测序区域⼜该如何选择？
今天，我们就来聊聊16S测序中的引物选择。
⾸先要了解⼀下16S是个啥？
详情在之前的中详细说过，16S是⼀段序列，是原核微⽣物的“⾝份证”，你拿到这段序列，再跟数据库⼀⽐对，所有的物种信息你就完全明了了。因为操作简单，可⾏性⾼，⽐对信息准确，所以被认为是微⽣物多样性组学研究中最常⽤的检测⼿段。
16S说完了，再来了解⼀下16S测序区域是个啥？sysloader
16S rRNA为核糖体的RNA的⼀个亚基，16S rDNA就是编码该亚基的基因。16S rDNA基因全长1542 bp，由9个可变区（V1-V9）和10个保守区组成。不同种类的细菌有相同的保守区序列和不同的可变区序列，因此可以根据保守区序列设计引物来扩增环境样品中所有细菌16S rRNA基因，⽽根据可变区序列来区分不同种类的细菌。
图1 16S rDNA基因组成（绿⾊为可变区）
传统⽅法中最常⽤的引物是27F和1492R，⼏乎能扩增出完整的16S rRNA基因全长，由于⽬前⼆代⾼通量测序的读长限制，该引物不适⽤于⾼通量测序平台，但被⼴泛⽤于纯菌的分⼦鉴定。考虑到⽬前主流⾼通量测序平台读长的限制，只能对16S rDNA的某⼀段可变区进⾏测序。有⽂献中选择测单V区（V3/V4/V6），有的测双V区（V3-V4区或V4-V5区），还有的选择三V区（V1-V3区、V5-V7区或V7-V9区）进⾏16S rDNA测序。
那么问题⼜来了，到底选啥才能测的稳准狠啊？！
别急，且听⼩编慢慢道来~
想测的准，毫⽆疑问当然长度越长越准确嘛，但是出于经济实惠的⾓度考虑，其实测双V甚⾄单V区已经⾜够。⼀般⽽⾔，环境微⽣物组学常⽤的，也是认可度⽐较⾼的测序区域是V3-V4，V4-V5，或者单测V4区。
那不同的测序区域对数据结果有什么影响呢？
肽链合成过程先来看看中科院周宁⼀⽼师于2013年发表在AEM杂志的⼀篇⽂章（IntragenomicHeterogeneity of 16S rRNA Genes Causes Overestimation of Prokaryotic Diversity），研究⽐较了16S不同区域的测序结果，所选择的引物如下：
研究结果显⽰，V4-V5区域是最佳的测序区域，造成的基因组内异质性最⼩。
也就是说⼀般会选择常⽤的V4-V5区，引物515F/907R 或者515F/926R。这也是罗⽒454测序时代最常⽤的16S测序引物。
图2 地球微⽣物组计划中使⽤的16S测序引物
传统的V4区引物，由Caporaso等科学家(2012)设计，对细菌的覆盖度⾼，也可以同时检测到部分古菌。然⽽随时数据库的⽇益更新，我们发现这对引物虽好，但还是有改善空间的。既然可以细菌古菌
通测，那我们能不能改进⼀下，让古菌覆盖的更⼴泛⼀些。
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转眼到了2015年，Parada等科学家发现，传统的V4区引物（515F/806R），会对海洋中SAR11落的检测造成低估，同时对γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）造成⾼估，因此他们对传统V4区引物的515F的⼀个兼并碱基做了改进，并结合926R引物，对海洋中的微⽣物多样性进⾏了检测，发现改进后的515F引物可以有效地改善扩增偏好性。
秉承着追求科（wu）学（mei）严（jia）谨（lian）的⽬标，越来越多的科学家想要在有限的经费内获得更多覆盖⾯更全的序列信息，于是Apprill等科学家在515F改善的基础上，进⼀步改善了806R端（嗯，也是只改了⼀个兼并碱基⽽已），相⽐原先的806R端其覆盖⾯更⼴了。他们推销的⼝号是“我的⽚段虽然短！花钱更少测的好！”
好吧，Caporaso眼看⾃⼰⾟苦设计出来的引物都被改进了，虽然改的好，但直接说出来岂不是太没⾯⼦了。于是2016年，⼏个相关科学家联⼿发表了⼀篇⽂章（Walters et al. 2016），使⽤不同的环境样品对这⼏对引物进⾏了⽐较。最后研究证明，改进后的V4区引物（515F/806R）确实效果不错，相⽐之前，不仅对细菌落的检测进⾏了矫正，还可以多测出来好多古菌，⼀举两得！
注：上表是改进前后引物序列的详细信息，改进的碱基⽤⿊体加粗了。
此⽂发表后，地球微⽣物组计划也与时俱进的把这两对改进后的引物列在了⾃⼰的⽹站，希望更多的环境微⽣物组学科学家可以来规范使⽤引物，⽅便进⾏不同环境的研究对⽐。截⽌⽬前，短短不到⼀年时间内，⾕歌学术检索到引⽤改进后V4区引物（515F/806R）的⽂献已有8篇，其中包括⼀篇Cell（Sampsonetal.2016）和⼀篇Nature
Microbiology（Snijdersetal.2016）。
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Microbiology（Snijdersetal.2016）。
图3 截图⽰例地球微⽣物组计划改进后的16S测序引物
因此对于环境样本⽽⾔，使⽤改进后的V4区引物（515F/806R）及515F/926R，可能在⾏业标准⽇益规范的今天，是⼀个更好地选择，今后应该会成为16S检测微⽣物多样性测序的⾸选。
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简⽽⾔之，V4单区测序（改进后的515F/806R引物）将是16S测序的主⼒~
那么最重要的问题来了
这么好⽤的引物，联川作为业内领先的微⽣物组学研究服务商，收⼊了吗？
这还⽤说，早已收⼊囊中~
沐浴粉现在起，您就可以使⽤联川16S rDNA V4区的微⽣物落多样性分析啦~
•
实验周期缩短
•
测序深度扩⼤
•
引物扩增偏好性得到改善
•
检测结果覆盖⾯更⼴
够不够~
这些就是吸引你来理由~
本⽂整理⾃微⽣物⽣态
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