于克儒
快速诊断用超敏C反应蛋白检测试剂盒的研制及性能评价 张小燕;高静贤
【摘 要】目的 研发一种配套床边快速散射比浊仪使用的全血检测超敏C反应蛋白试剂盒.方法 根据乳胶增强散射比浊法的原理,用溯源至NIBSC标准品的工作校准品制定射频卡,含有表面活性剂的试剂1及含有致敏胶乳的试剂2与样品反应后,根据射频卡的标准曲线换算浓度.结果 本试剂盒线性范围0.05 ～ 30mg/L,灵敏度为0.05 mg/L,批内CV值分别为0.85％和0.42％,日间CV值分别为1.85％和1.65％,对血红蛋白、胆红素、甘油三酯有较强的抗干扰能力.结论 本试剂盒与商品化试剂配套生化仪检测系统比对,结果相关性较好,符合临床快速诊断的要求.%Objective To evaluate ahs-CRP assay kit for point-of-care testingnephelometry analyzer,whichcan be used to detect CRP with whole blood sample.Methods According to the principle oflatex-enhanced nephelometry,making the cardwith product calibration tracing to the NIBSC standard,the samplesreact with the reagent 1 which contains the surfactant and the reagent 2 containing the sensitive latex,and then convert the concentration according to the standard curve of the card.Results The measurement range was0.05-30m g/L,sensitivity was0.05mg/L,intra-variation coefficients were0.85％ and 0.42％ and inter-dayvariation coefficients werel.85％ and 1.65％ respectively.The kit also has high anti-jamming capability towards hemoglobin,bilirubin and triglyceride.Conclusion The hs-CRP assay system showed high correlation with the regents on market used in automatic biochemical analyzer.The hs-CRP kit could meet the requirements of rapid and accurate clinical diagnosis.
【期刊名称】《标记免疫分析与临床》
微型拉曼光谱仪【年(卷),期】2017(024)002
【总页数】7页(P229-235)
【关键词】超敏C反应蛋白;乳胶增强;散射比浊;床边快速诊断;性能
【作 者】张小燕;高静贤
【作者单位】南瓜加工江苏省医疗器械检验所,江苏南京210012;江苏省医疗器械检验所,江苏南京210012384孔板
【正文语种】中 文
C反应蛋白（CRP）是一种由肝脏产生的急性时相蛋白，肌体正常时血清中的CRP含量极低。在感染、炎症、肿瘤、创伤及冠心病时浓度会升高［1］。临床上通常将其视为一种非特异性的、敏感的炎症指标，同时也是心血管疾病最有力的预测指标之一［2-3］。近年来，随着检测技术的发展，采用超敏感方法检测到的CRP称之为“超敏CRP（high sensitive C-reactive protein，hs-CRP）”。在正常人中，用于预测心血管疾病风险时，hs-CRP浓度在＜1mg／L，1～3mg／L，＞3mg／L时分别代表低度危险，中度危险与高度危险［4］。同样，在用于心脑血管病的及愈后监测中，hs-CRP也发挥重要作用。比较一致的观点是冠心病患者入院时hs-CRP＞10 mg／L提示再发事件可能性大，出院患者hs-CRP＞3 mg／L即有预测价值［5］。因而快速准确测量血液hs-CRP则显得尤为重要。传统的检测模式是在医院检验科集中检验，获得检测结果所需时间较长，不利于门诊、病人床边及社区诊所的快速诊断要求［6］。近年来，床边检测系统发展迅速，其中散射比浊系统因其灵敏度高，准确性好备受推崇。本研究根据市场的需要，研发出了配套床边快速散射比浊仪的全血hs-CRP测定试剂盒，现将之研发过程及性能评价报道如下。
羊抗人CRP多克隆抗体（罗氏诊断有限公司）；羧基化聚苯乙烯微球（挪岛科技有限公司）；C反应蛋白（桂林英美特生物科技有限公司）；英国国家生物制品检定所发售的 CRP标准品（货号：NIBSC code：85／506）；赋值质控品（英国朗道实验诊断有限公司）；临床血清／全血样本（南京市第一医院）；水溶性碳化二亚胺（EDC，Sigma公司）；N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS，阿拉丁试剂有限公司）；高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；血液混匀仪（新康医疗器械有限公司）；超声波破碎仪（南京舜玛仪器设备有限公司）；快速散射比浊仪（南京普朗医用设备有限公司）；CL-8000全自动生化分析仪（岛津公司）；对照hs-CRP试剂盒（日本积水）。 2．1 制备致敏胶乳溶液
取粒径为160nm，固含量为10%的羧基化聚苯乙烯微球1mL加入至离心管中，加入活化缓冲液［pH5．5的 2-（N-啉）乙磺酸缓冲液］9mL，25000×g离心20分钟，倾去上清，反复洗2次。洗涤后加入5mL活化缓冲液重悬微球，接着向其中分别加入2．5mL的N-羟基硫代琥珀酰亚胺水溶液（浓度为9．6mg／mL）与 2．5mL的水溶性碳化二亚胺水溶液（浓度为12mg／mL），立即震荡混匀，置于血液混匀仪室温混匀反应20分钟。将活化后
的微球以25000×g离心20分钟，用反应缓冲液［pH6．2的2-（N-啉）乙磺酸缓冲液］清洗2次，再加入5mL反应缓冲液，超声分散2min后，向其中加入5mL 3mg／mL的羊抗人多克隆抗体（用反应缓冲液稀释后的抗体），于血液混匀仪30℃混匀反应2小时，尔后向反应体系中加入50μL乙醇胺及50mg牛白蛋白，封闭反应20分钟。用保存缓冲液（10mM pH 7．4 HEPES buffer，其中含 0．1%BSA，0．8%NaCl，0．1%Tween-20，0．1%NaN3）清洗 3次，超声分散 2min后保存于50mL保存缓冲液中。此即为致敏胶乳溶液，此致敏胶乳为试剂2。
2．2 工作校准品的配制
工作校准品采用C反应蛋白为主要原料，以类血清基质溶液配制得到。其量值溯源链参见图1。
其中，一级校准品采用了英国国家生物制品检定所发售的 CRP标准品（货号：NIBSC code：85／506），厂商选定测量程序选用积水医疗科技（中国）有限公司生产的CRP检测试剂盒（免疫比浊法）。具体的赋值程序如下：
（1）准备
a随机抽取10支分装好的CRP工作校准品，从2～8℃环境中取出，平衡放至室温。
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b查看温湿度表，保证测量环境在温度在18～30℃之间，湿度在80%以下，运行自动生化仪，准备好积水医疗科技（中国）有限公司的CRP检测试剂盒（免疫比浊法）。
（2）校准rrggg
按照市售的积水医疗科技（中国）有限公司的CRP检测试剂盒（免疫比浊法）的使用说明书，在仪器控制软件里设置好预定参数，将C反应蛋白的国际标物NIBSC按照要求复溶后，以工作校准品基质溶液稀释成 50mg／L、25mg／L、5mg／L、2．5mg／L和0mg／L五个浓度的定标品，运行定标程序。
（3）测量
运行生化仪测量10支CRP工作校准品，每支校准品测量1次结果，测量完成后，记录测量数据，将校准品放回2～8℃保存。连续测量5天，对所有测量数据汇总统计，取其平均值为校准品的靶值，并计算定值不确定度SD定值；
（4）定标卡制备
将CRP工作校准品以类血清基质溶液按照0∶1、1∶1、3∶1、15∶1和1∶0的不同比例稀释成 5个浓度，在AT-100全自动特定蛋白分析仪上按照定标程序定标，得到得到吸光度变化值和浓度的定标曲线，将定标曲线的参数制作成预定标信息，将此信息录入专用射频卡即得定标卡。
选临床标本40例，对选定测量程序和常规测量程序的检测结果进行相关性分析，要求相关性R＞0．9，t检验 P＞0．05，证明两组数据无显著性差异，工作校准品的互换性得到确认。
2．3 反应体系及测定方法
在反应杯中加入400μL试剂1（pH7．4的磷酸盐缓冲液，含0．5%表面活性剂BL-9、0．1% 牛白蛋白、2．5%聚乙二醇6000、0．1% 叠氮钠），再加入6μl全血或3．9μL血清／血浆／质控品样本，轻摇均匀，于37℃金属浴加热2min，完全溶血后，取出加入预先平衡至室温的试剂2，轻晃均匀后，插入快速闪射比浊仪的反应孔中，1分钟后仪器根据预先写入射频卡的标准曲线直接显示测定值。
2．4 分析性能评估
2．4．1 空白限：以5% 牛白蛋白溶液为空白样本，按上述测定方法于快速散射比浊仪测定20次，以空白均值加两倍标准差报告空白限。
2．4．2 线性范围：取已知CRP高浓度标本和低浓度标本，按照一定比例混合得到9个浓度的标本，每个浓度测定3次，计算平均值，与理论浓度进行比较，以偏差10%为界限，判断其线性范围。
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