一、实验目的
1.学习植物细胞原生质体分离纯化的方法。
2.了解原生质体活性鉴定的原理。
3.了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理及其过程
二、实验原理
去掉植物细胞壁的方法可以是机械的人工操作，也可以利用酶解法。较早利用机械法制备原生质体的
酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维 素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。由于原生质体内 部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜，必须 保持在渗
透压平衡的溶液中才能保持其完整性。 其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液 的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质 体的影响。
测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双 醋酸酯(FDA)染是常用的一种方法，FAD 本身无荧光，无极性，可透过完整的原生质膜。 一旦进入原生质体后，由于受到酯酶分解而产生 具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原 生质膜，因此有活力的细胞能产生荧光，无活力 的原生质体不能分解FAD无荧光产生。
PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗．使原生质体融合得以完成。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH室内养殖泥鳅设备由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。
原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。
三、实验用品
1．材料：绿豆，烟草幼苗叶片，油菜或菠菜或烟草等。
2．试剂：
风力摆控制系统酶解液(绿豆)：1%(W/V) 纤维素酶，1% (W/V)果胶酶，0.7mol/L甘露醇;10mmol/L CaCl， 2.2H2O，0.7mmol/L KH2PO4，pH 6.8～7.0。
13%CPW洗涤液(绿豆)：27.2mg/L KH2PO4，101.0 mg/L KNO3，1480.0mg/LCaCl，2.2 H2O，246.0 mg/L MgSO4，0.16 mg/L KI，0.025 mg/L CuSO4·5H2O婴儿电动摇篮床，13%(W/V)甘露醇，pH 6.0。富氧设备
0.1％2-N-啉乙磺酸钠或三羟 甲基氨基甲烷溶液：内含20％蔗糖，pH6.0。
0.02%二乙基荧光素(FDA):5mgFDA溶于1ml丙酮中，避光4℃下贮存，使用 时取0.22mlFDA贮存液加入5ml0.65mol/L甘露醇中.使用时，使最终浓度为0.01%。
20%蔗糖溶液
无菌蒸馏水。
3．仪器：摇床，离心机，倒置显微镜，普通显微镜，超净工作台，培养皿，离心管，载玻片，刀片，镊子，过滤漏斗，200目筛网，吸管，高压蒸汽，消毒锅，镊子，解剖刀。
四、实验方法步骤
1. 分离原生质体——绿豆幼苗下胚轴：
(1) 绿豆种子用70%乙醇消毒，自来水流 水浸泡点火模块4h左右，于湿滤纸上萌发。25℃黑暗中培养约60h。取幼苗下胚轴或根为材料进行分离原生质体。
(2) 取黄化幼苗下胚轴2～3g，从弯钩下3mm处 向下切取约5mm的切段，切成0.5mm的薄片置于10 ml酶解液中(也可以取1 cm左右的绿豆幼苗的根尖作为实验材料，直接置于酶解液中光栅化)。置于摇床上，25～28℃，60～70r/min，酶解6～7h。
(3) 用200目筛网过滤酶解液(制一张装片，观察)，滤液经 1000rpm离心5min，弃去上清液。
(4) 用3～4ml13%CPW液洗涤并溶解沉淀，悬液经1000rpm离心5min，留1ml上清液，其余弃之。
(5) 取10ml离心管1支，注入3ml20%～25%蔗糖，将沉淀的原生质体悬浮，用滴管吸出悬液小心地铺于蔗糖溶液上，1000rpm离心5～8min，将位于中间一层的原生质体用吸管小心吸出至另一离心管中，沉淀制一张装片，观察。
(6) 用13% CPW液洗涤1～2次，每次1000rpm离心5min，得到较为纯净的原生质体。用13% CPW液悬浮至一定密度并制一张装片，观察。
(7) 取1滴原生质体提取液在载玻片上，加入相同体积的0.02%FDA稀释液，静置2min 后，于荧光显微镜下观察，发绿荧光的为有活力的原生质体，没有产生荧光的原生质体无活力。
(8)将1-2滴原生质体混合物（密度分别为105一106/ml）滴入小培养皿，静置8—10分钟。
相对方向加入2滴40％的PEG溶液，静置10分钟，依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml含13％甘露醇的CPW洗液洗涤，注意在第二、三次洗液加入前，用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则原生质体破碎死亡；最后用液体培养基洗l一2次即可进行培养：
(9)培养
将原生质体或融合体悬液铺于愈伤组织诱导培养基（固体）上进行浅层培养，在温度25±2℃，光照度1000Lx,光照14～16h/d 的条件下培养，经1-2个月后在培养基上出现肉眼可见的细胞团。细胞团长到2～4mm左右，即可转移到分化培养基上，诱导分化芽和根，长成小植株。
3、收集纯化
（1）用吸管将酶解液吸至5mL离心管中，以600rpm离心5分钟以上，使原生质体沉降
（2）将上清（酶解液）回收，剩下原生质体及残渣于管底
（3）加氯化钙液约2mL，轻轻吹打均匀
（4）用注射器向离心管底部缓缓注入蔗糖约2—3mL，出现下部蔗糖液，上部原生质体悬浮液
（5）以600rpm离心10分钟，在两液相之间出现一条绿带，便是纯净的原生质体
4、观察或培养
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