降低斑马鱼cntnap2表达建⽴注意缺陷多动障碍遗传模型
摘要
⽬的
通过降低斑马鱼接触蛋⽩相关蛋⽩基因2（contact protein-related protein gene 2, cntnap2）表达，建⽴注意缺陷多动障碍（attention-deficit/hyperactivity disorder，ADHD）遗传模型。 ⽅法
以注射剪接抑制型吗啉代寡聚核糖核酸降低cntnap2表达的斑马鱼作为实验组（ n =48），注射随机寡核苷酸⽚段的斑马鱼作为对照组（ n =48)，通过原位杂交观察斑马鱼神经递质系统相关基因th、dbh、gad1b、glyt2、vglut2表达的变化，使⽤实时荧光定量PCR检测神经递质系统及神经元发育相关基因表达量变化。使⽤斑马鱼⾏为轨迹跟踪系统记录（Noldus⾏为仪）检测cntnap2表达降低后多动/冲动⾏为及托莫西汀对多动/冲动⾏为的改善作⽤。
结果
原位杂交实验结果显⽰实验组较对照组神经递质系统相关基因dbh表达减少，gad1b表达增加；th、glyt2、vglut2表达未见明显差异。实时荧光定量PCR显⽰实验组较对照组神经递质系统相关基因dbh表达降低（ t =5.772， P
=0.005），snap25、dat、gad1b表达增⾼（ t =14.310、22.210、22.090，均 P <0.01）；神经元发育相关基因shha、epha4b、netrin1b、noi及神经递质系统相关基因drd4、th、vglut2、glyt2表达差异均⽆统计学意义。6 dpf时药物未处理实验组较药物未处理对照组幼鱼游动总距离长［143.12(98.56, 212.22) cm 与99.03(80.54, 133.96) cm， Z =-3.547， P <0.01］，平均游动速度快［0.050(0.041, 0.067) cm/s与0.033(0.025, 0.042) cm/s, Z =-5.495， P <0.01］；经托莫西汀处理后，实验组药物处理较药物未处理幼鱼游动总距离减少［106.59(95.28, 120.10) cm与143.12(98.56, 212.22) cm, Z=-3.591， P <0.01］，平均游动速度减慢［0.031(0.028, 0.037) cm/s与0.050(0.041, 0.067) cm/s， Z =-7.035， P
<0.01］。
结论
cntnap2表达降低斑马鱼可通过改变dbh、snap25、dat、gad1b表达量⽽产⽣多动/冲动表型，托莫西汀可有效缓解多动/冲动表型，cntnap2表达降低斑马鱼可作为ADHD遗传模型。
注意缺陷多动障碍（attention-deficit/hyperactivity disorder，ADHD）是临床上最常见的⼀种神经发育障碍性疾病，主要表现为与年龄不相符的注意⼒不集中、多动、冲动，并且可持续终⽣。通过Meta分析显⽰全球5%的⼉童受该病困扰。ADHD平均遗传度为0.76［1］。Mooney等［2］对来⾃精神疾病基因组联盟的2个ADHD GWAS数据进⾏通路分析，其结果⽀持神经递质释放调节、神经突⽣长和轴突导向与ADHD相关的假说。研究提⽰ADHD发病与遗传相关，发病机制与神经系统发育、神经递质系统相关。我们课题组在ADHD患者中通过GWAS分析发现接触蛋⽩相关蛋⽩基因2（contactin-associated protein-like 2,CNTNAP2）为ADHD的候选基因［3］。Elia等［4］报道CNTNAP2基因与ADHD相关。CNTNAP2基因纯合突变的⼉童具有多动、冲动的⾏为表型［5］。Bisgaard等［6］研究发现⼀对双胞胎⼉童的7号染⾊体长臂3区4带⾄3区6带2亚带缺失，伴有严重的注意缺陷和多动，⽽CNTNAP2基因就位于该区段。以上研究提⽰CNTNAP2基因功能异常可能出现ADHD症状。
CNTNAP2基因含有25个外显⼦，编码轴突蛋⽩相关细胞黏附分⼦，即CNTNAP2蛋⽩或CASPR2蛋⽩，是轴突蛋⽩超家族的⼀员，在脊椎动物神经系统中具有细胞黏附分⼦及受体的功能。⼈脑发育时CNTNAP2信使RNA（mRNA）显著富集于额叶、颞叶，成年时⼤脑中纹状体回路及额叶⽪质也显著富集［7］。1项MRI研究显⽰，CNTNAP2基因的变异与额叶灰质减⼩及功能连接改变相关［8］。以上研究提⽰CNTNAP2基因可能参与神经系统的发育。斑马鱼的脑和脊髓与⼈类相应神经解剖结构⾼度保守，并且约70%的基因与⼈类同源，因此是良好的实验动物。既往研究显⽰在⼩⿏中敲除该基因
出现多动/冲动表型［9］，⽽引起多动/冲动表型的机制有待进⼀步研究，本研究中我们拟在斑马鱼受精卵阶段降低cntnap2基因表达，探讨其功能缺陷对斑马鱼胚胎发育神经系统基因表达和幼鱼⾏为的影响，尝试建⽴ADHD的遗传模型。
材料和⽅法
⼀、材料
本研究起⽌时间为2017年7⽉⾄2019年7⽉。
1.实验动物：以Tubingen(Tu）品系斑马鱼作为野⽣型（wild type, WT），由北京⼤学⽣命科学学院中⼼鱼房提供。饲养条件：光周期为14 h光照/10 h⿊暗交替，⽔温28.5 ℃。于晚餐饲喂完毕后配鱼，雌雄⽐为1∶1或2∶1。将鱼卵收集到培养⽫中，⽤吸管挑卵、粪便等，更换为幼鱼培养液E2（1 mmol/L氯化钙、0.5 mmol/L氯化钾、0.15 mmol/L磷酸⼆氢钾、0.05 mmol/L磷酸氢⼆钠、0.7 mmol/L碳酸氢钠、15 mmol/L氯化钠和1 mmol/L硫酸镁），将鱼卵置于恒温培养箱（28.5 ℃）中培养。每天观察胚胎的发育情况，挑除死卵、未受精卵、卵膜碎⽚以及发育畸形的胚胎，并换幼鱼培养液，以避免霉菌滋⽣⽽致其他正常胚胎死亡。⽤受精后天数（day pose-fertilization, dpf）描述幼鱼的时期。未进⾏注射的斑马鱼作为野⽣型组，以注射cntnap2基因剪接抑制型啉反义寡核苷酸降低cntnap2表达的斑马鱼作为实验组，以注射随机啉反义寡核苷酸的斑马鱼作为对照组。
2.药品及试剂：cntnap2基因剪接抑制型啉反义寡核苷酸，序列为：5′-AGCACCTACAGA AACAGCACCATAC-3′，作⽤于位点内含⼦1/外显⼦2，随机啉反义寡核苷酸为对照，注射浓度：0.5 nmol/L，注射量为1 nL (Gene Tools公司, 美国)；Trizon RNA提取试剂盒（Invitrogen公司, 美国）和cDNA第⼀链合成试剂盒（Promega公司，美国)，SYBR%uAE Green SuperMix-UDG定量PCR试剂盒（Invitrogen公司，美国)，RNA纯化试剂盒（QIAGEN公司，德国)，T3/T7/SP6 RNA聚合酶（Promega公司，美国)，NBT/BCIP底物显⾊剂（Promega公司，美国)，抗DIG AP-Conjugate 抗体（Roche公司, 中国)；托莫西汀（Tocris公司，英国）。
⼆、⽅法
1tnap2基因剪接抑制啉反义寡核苷酸效⽤检测：在斑马鱼胚胎单胞期实验组注射cntnap2基因剪接抑制啉反义寡核苷酸、对照组注射随机啉反义寡核苷酸，待发育到3 dpf时收集幼鱼提取RNA，反转录cDNA，进⾏PCR（引物序列为：cntnap2-F：5′-AGCTATGTTCCAGGATACGCC-3′，cntnap2-R：5′-CAAATAACGGGCCACAACCG-3′；%u3B2-actin-F：5′-CGAGCTGTCTTCCCATCCA-3′，%u3B2-actin-R：5′-TCA- CCAACGTAGCTGTCTTTCTG-3′），为了进⼀步明确cntnap2基因剪接抑制啉反义寡核苷酸敲低cntnap2基因表达量是通过内含⼦1保留还是外显⼦2缺失，从⽽设计Primer1和Primer2，Primer1位于外显⼦1和内含⼦1，引物序列为：F：5′-AGCTATGTTCCAGGA-TACGCC-3′，R：5′-GAGTGTACGGTTTTGCTAAC-3′；Primer2位于外显
单晶硅生产工艺⼦1和外显⼦2，引物序列为：F：5′-TGTGATGAAGCTCTGGTC-3′，R：CCAGATGTTGCC- ATCTTG-3′进⾏验证；Primer3为%u3B2-actin，序列同前。
2.原位杂交实验：根据Ensembl（斑马鱼zv9）数据库提供的基因组信息及⽂献报道，设计合适的引物，克隆基因⽚段并测序正确后，将正确的⽚段连接到Ez-T载体（GeneStar公司）上。构建好载体后，通过测序确定连接⽅向，然后选择合适的内切酶线性化该载体，最后进⾏体外合成RNA探针。利⽤th、dbh、gad1b、glyt2、vglut2 RNA探针标记⼉茶酚胺类神经元、去甲肾上腺素能神经元、%u3B3-氨基丁酸能神经元、⽢氨酸能神经元、⾕氨酸能神经元，通过原位杂交实验观察这些神经元的变化。合成RNA探针的引物序列见表1。
在发育到受精后10 h（hour pose-fertilization, hpf）时加⼊1-苯基-2硫脲（1-Propyl-2-thioura, PTU)，抑制⾊素⽣长，分别收集1 dpf、2 dpf、3 dpf、4 dpf胚胎，⽤4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固定，然后进⾏原位杂交，具体实验⽅法参见⽂献［10］。
原位杂交实验后图像采集：将原位杂交的胚胎放⼊滴有70%的⽢油或2.5%的甲基纤维素的凹槽载玻⽚上，按照⼀定体位摆好，使⽤蔡司Z1显微镜采集图像，放⼤倍数为⽬镜10倍，物镜20倍。
3.实时荧光定量PCR：分别收集1 dpf、3 dpf幼鱼，提取RNA，反转录cDNA，然后进⾏实时荧光定量PCR检测，引物序列见表2。
溶液聚合
4.⾏为及药物实验：在斑马鱼胚胎单细胞期分别注射cntnap2基因剪接抑制啉反义寡核苷酸和随机啉反义寡核苷酸。待⽣长到6 dpf时，将幼鱼置于48孔板，放⼊Noldus⾏为仪，记录运动轨迹；⾸先让幼鱼在⾏为仪中适应10 min，然后开始记录，记录1 h内的游动数据；⾏为仪提供28.5 ℃恒温环境。将实验组与对照组各分为药物处理和药物未处理2种情况，药物处理的⽅法为将幼鱼置于含有5 %u3BCmol/L托莫西汀（购⾃Tocris公司）的E2溶液中1 h，托莫西汀的E2溶液现⽤现配；使⽤Noldus EthoVision XT进⾏运动轨迹⾏为分析，观测药物处理与未处理幼鱼游动距离和游动速度。
5.统计学处理：数据使⽤SPSS 22.0进⾏分析，基因表达量根据每个基因CT值，采⽤2-%u394㥌T计算变化倍数，以x%uAF%uB1s表⽰，采⽤独⽴样本 t 检验进⾏组间⽐较。实验组与对照组斑马鱼及经过托莫西汀处理后的斑马鱼在1 h 内的游动距离、游动速度数据以中位数（四分位数）表⽰，采⽤⾮参数检验Mann-Whiteny U 检验进⾏组间⽐较， P
<0.05为差异具有统计学意义。
<0.05为差异具有统计学意义。
结果
⼀、注射cntnap2基因剪接抑制啉反义寡核苷酸后cntnap2表达⽔平检测
注射cntnap2基因剪接抑制啉反义寡核苷酸后实验组较野⽣型组及对照组cntnap2基因表达量降低，实验组可以被Primer1扩增，⽽对照组不能被Primer1扩增，表明实验组内含⼦保留，对照组和实验组均可被Primer2扩增，表明外显⼦没有缺失，对照组和实验组均可被Primer3扩增，表明对照组和实验组⽤于该扩增实验的模板没有问题；将Primer1扩增出来的产物送到擎科⽣物公司进⾏测序，经⽐对结果显⽰Primer1扩增的序列为⽬标⽚段。故该cntnap2基因剪接抑制啉反义寡核苷酸是通过引起内含⼦保留⽽导致cntnap2基因表达降低，见图1。
Primer1产物为428 bp，Primer2产物为300 bp，%u3B2‑actin产物为171 bp
图1 实验组（ n =30）、野⽣型组（ n =30）及对照组（ n =30）cntnap2基因表达凝胶电泳图（A）以及cntnap2基因剪接抑制啉反义寡核苷酸通过保留内含⼦致cntnap2表达降低（B）
⼆、原位杂交实验2组神经递质系统神经元标志基因变化
原位杂交实验显⽰，实验组较对照组dbh表达减少，gad1b表达增多，th、glyt2、vglut2的表达未见明显差异；见图2。A为1 dpf、2 dpf、3 dpf时⼉茶酚胺类神经元分布；B为1 dpf、2 dpf、3 dpf时去甲肾上腺素能神经元分布；C为1 dpf、2 dpf、3 dpf时%u3B3‑氨基丁酸能神经元分布；D为2 dpf、3 dpf、4 dpf时⽢氨酸能神经元分布；E为2 dpf、3 dpf时⾕氨酸能神经元分布；RM为对照组；MO为实验组
图2 蔡司Z1显微镜下实验组（ n =15）和对照组（ n =15）神经递质系统神经元标志基因变化原位杂交实验染⾊ %uD7 200
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三、2组神经递质系统及轴突导向基因表达量变化
实时荧光定量PCR检测⽰，实验组较对照组dbh表达量降低，gad1b、dat、snap25表达量增⾼，且差异均有统计学意义，⽽th、drd4a、glyt2、vglut2、shha、epha4、netrin1b、noi表达量差异⽆统计学意义；见表3。
四、托莫西汀药物实验2组⾏为学指标⽐较
6 dpf时，未⽤药物处理时，实验组较对照组游动总距离增加、游动速度增快，差异具有统计学意义（均 P <0.01）。使⽤托莫西汀后，实验组药物处理较未处理游动距离减少、平均游动速度减慢，差异具有统计学意义（ P <0.01）；见表4。
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本研究结果显⽰在斑马鱼中cntnap2表达降低的情况下神经递质系统相关基因dbh表达量降低，snap25、dat、gad1b表达增⾼；神经元发育相关基因shha、epha4b、netrin1b、noi及神经递质系统相关基因th、glyt2、vglut2、drd4、th、vglut2、glyt2表达量变化差异⽆统计学意义。cntnap2表达降
低斑马鱼表现出ADHD相似表型且该表型可以被托莫西汀改善。以上结果提⽰cntnap2表达降低斑马鱼可能是ADHD的遗传模型。
在受精卵阶段cntnap2表达降低的斑马鱼发育到6 dpf时，表现为在观察时间内游动总距离增加、游动平均速度增快，提⽰cntnap2表达降低斑马鱼表型具有类似ADHD的⾏为表型，与临床观察CNTNAP2基因纯合突变的⼉童具有多动/冲动的⾏为表型［4, 5, 6］以及在⼩⿏中该基因表达缺失产⽣的表型⼀致［9］，提⽰cntnap2可能参与ADHD的发病。cntnap2表达降低的斑马鱼⾏为表现符合ADHD的表⾯效度。本研究显⽰ADHD药物托莫西汀可有效改善cntnap2表达降低斑马鱼的多动/冲动表型，表现为cntnap2表达降低的斑马鱼使⽤托莫西汀后游动总距离减少、游动平均速度减慢。药物处理实验表现符合ADHD的预测效度。
斑马鱼cntnap2表达降低后，神经系统基因表达出现以下变化：（1）dbh表达量降低：提⽰去甲肾上腺素合成减少。在⼩⿏中dbh缺失后中枢神经系统去甲肾上腺素减少［11］，该结果符合Biederman等［12］提出的ADHD可能是去甲肾上腺素能障碍的假说。（2）gad1表达量增⾼：提⽰%u3B3-氨基丁酸合成可能增加，%u3B3-氨基丁酸能神经元在多巴胺的调节中起着重要的作⽤［13］，有研究报道ADHD⼉童%u3B3-氨基丁酸合成增加与⾏为和情感调节障碍发⽣相关［14］。（3）dat表达量增多：提⽰多巴胺合成可能增多，多巴胺也是ADHD药物哌甲酯的主要作⽤靶点［15］。（4）snap25表达量增多：提⽰SNAP25合成可能增多，该基因编码突触体相关蛋⽩，是⼀种突触前膜结合蛋⽩，
参与神经递质的囊泡释放［16］。研究显⽰SNAP25单核苷酸多态性与ADHD相关［17, 18］，SNAP25是ADHD的易感基因［19］。降低cntnap2表达后神经系统基因表达变化符合ADHD病理机制，具有结构效度。
斑马鱼中枢神经系统结构和其他脊椎⽣物相似，斑马鱼的脑和脊髓与⼈类相应神经解剖结构⾼度保守，与⼈类有约70%的基因同源［20, 21］。⽬前，斑马鱼已⽤于多种精神疾病研究，如精神分裂症［22］、孤独症［23］、创伤后应激综合征［24］、ADHD［25, 26, 27］等。托莫西汀是临床上常⽤的ADHD药物，通过选择性抑制突触前转运体的再摄取，增加前额叶⽪质突触间隙去甲肾上腺素和多巴胺的浓度⽽发挥作⽤。Lange等［25］敲低斑马鱼lphn3.1后，发现较野⽣型斑马鱼游动总距离增多、游动平均速度增快，托莫西汀可改善lphn3.1表达降低斑马鱼的多动/冲动表型，同时发现多巴胺系统受损。Huang等［26］发现per1b功能缺失斑马鱼也出现了多动/冲动表型且可被ADHD药物改善，同时发现多巴胺减少。Yang等［27］发现micall2表达降低斑马鱼也出现了多动/冲动表型且可被托莫西汀改善。良好的动物模型应该满⾜表⾯效度、结构效度、预测效度。本研究显⽰cntnap2表达降低斑马鱼出现类似ADHD多动/冲动表型，⽀持表⾯效度；cntnap2表达降低斑马鱼dbh表达降低，gad1b、dat、snap25表达增⾼，符合结构效度；cntnap2表达降低斑马鱼多动/冲动表型能被托莫西汀改善，满⾜预测效度。因此，cntnap2表达降低斑马鱼有可能作为ADHD遗传模型。
本研究的局限性：斑马鱼作为⼀种新的模式动物，现有的许多抗体不特异或在实验中不能使⽤（如cnt
nap2抗体、神经元标志基因抗体等)，使得很多实验结果只能在基因转录⽔平上探究。神经元标志基因的变化提⽰递质系统可能存在改变，神经递质浓度有待进⼀步测量。
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