以饲料中维生素B2含量测定为例介绍荧光分光光度法测定维生素Ｂ2含量的方法。
采用标准：GB/T5009.85——2003，本标准规定了饲料中维生素B2测定方法。
1.1方法原理
维生素B2（即核黄素C17H20N4O6）在440nm紫外光激发下产生绿荧光，在一定浓度范围内其荧光强度与核黄素浓度成正比。用连二亚硫酸钠还原核黄素成无荧光物质，由还原前后荧光强度之差与内标荧光强度的比值，计算样品核黄素的含量。 除特殊规定外，本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或相应纯度的水。
1.2.1盐酸溶液，0.1mol／L，将8.5mL盐酸（GB 622）用水稀释至1000mL。 1.2.2盐酸溶液，1mol／L，将85mL盐酸用水稀释至1000mL
1.2.3氢氧化钠溶液，1mol／L，将井水空调40gNaOH（GB 629）溶于水定容至1000mL
1.2.4冰乙酸（GB 676）。
1.2.5冰乙酸溶液，0.02mol／L：将1.8mL冰乙酸用水稀释至1000mL。
1.2.6高锰酸钾（GB 643）溶液，40g／L。
1.2.7过氧化氢（HG 3─1082）溶液，100mL／L。现用现配。
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1.2.8核酸素标准溶液
核黄素贮备液Ⅰ：将核黄素于五氧化二磷干燥器中干燥24h，称取0.0500g，溶解于0.02mol／L乙酸溶液（3.2.5）中，在蒸汽浴上恒速搅动直至溶解，冷却后稀释至500mL。盛入棕瓶滴加甲苯覆盖，低温（4℃）保存。该溶液每毫升含0.1mg核黄素。
核黄素贮备液Ⅱ：取核黄素贮备液Ⅰ10mL用0.02mol／L乙酸溶液稀释至100mL，盛于棕瓶中滴加甲苯覆盖，低温（4℃）保存。该溶液每毫升中含10μg核黄素。
核黄素标准工作液：取核黄素贮备液Ⅱ10mL，用水稀释至100mL。现用现配。该溶液每毫升中含1μg核黄素。
1.2.9荧光素标准溶液
1.2.9.1荧光素贮备液：称取荧光素（Q／HG 22─786）0.0500g，用水稀释至1000mLoltc，盛于棕瓶中，低温（4℃）保存。该溶液每毫升中含50μg荧光素。
1.2.9.2荧光素标准工作液：取荧光素贮备液1mL，用水定容至1000mL，盛入棕瓶中，低温保存。该溶液每毫升中含0.05μg荧光素。
1.2.10溴钾酚绿pH指示剂：取溴钾酚绿（HGB 3386）0.1g，加氢氧化钠溶液（0.05mol／L）2.8mL使之溶解，再加水稀释至200mL。变范围pH4.6～5.2。
1.2.11光触媒滤网连二亚硫酸钠（Na2S2O4）（Q／HG 2─001），防止吸潮。
放血刀1.3仪器、设备对接焊缝
1.3.1荧光分光光度计。
1.3.2分析天平：感量0.0001g。
1.3.3电热恒温水浴。
1.3.4具塞玻璃刻度试管，15mL。
1.4分析步骤
1.4.1试样的制备
采集具有代表性的样品至少500g，四分法缩减至100g，磨碎，通过0.28mm孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。
1.4.2称样
单一饲料、配合饲料、浓缩饲料称取1～2g，精确至0.001g。维生素预混料称取0.25～0.50g，精确至0.0001g，将试样置于100mL容量瓶中。
1.4.3样液的制备（样品水解）
向盛样品的100mL容量瓶中加65mL盐酸溶液（0.1mol/L），于沸水浴中加热30min，开始加热5～10min时常摇动容量瓶，以防样品结块。或于121～123℃高压锅中加热水解样品30min。水解液冷却至室温后，滴加1mol／L的氢氧化钠溶液(3.2.3)调节pH至6.0～6.5，然后立即加稀盐酸溶液（1mol／L）使pH值约为4.5（溴甲酚绿指示剂变为草绿），用水稀释至刻度。
通过中速无灰滤纸过滤，弃去最初5～10mL溶液，收集滤液于100mL 锥形瓶中，滴加稀盐酸检查蛋白质，如有沉淀生成，继续加氢氧化钠溶液(3.2.3)，剧烈振摇，使之沉淀完全，稀释到测量体积。对高含量样品，取整分的澄清液，用水稀释至一定体积使含核黄素约为0.1μg／mL（以下操作避免紫外光照射）。
1.4.4氧化去杂质
于a、b、c三支15mL具塞刻度试管（3.3.4）中各吸入样液（3.4.3）10mL，同时做平行试验。向试管a、b、c中各加入1mL蒸馏水，向试管b中加入1mL核黄素标准工作液。然后各加入冰乙酸（3.2.4）1mL，摇动试管使样液混匀后逐个加高锰酸钾溶液（3.2.6）0.5mL，混匀，静置2min，再逐个加入过氧化氢溶液（3.2.7）0.5mL摇匀，使高锰酸钾颜在10s
内消退。加盖摇动，使试管中的气体逸尽。
1.4.5测定
用荧光素标准工作溶液（3.2.9.2）调整荧光仪，使其稳定于一定数值，作为仪器工作的固定条件。调整激发波长440nm，发射波长525nm，测定试管a、b的荧光强度，样液在仪器中受激发光照射不超过10s。在试管c中加入20mg连二亚硫酸钠，摇动溶解，并使试管中的气体逸出，迅速测定荧光强度作为空白。若溶液出现浑浊，不能读数。
1.4.6结果记录与计算
1）数据记录 将所测数据填入下表。
6-1：数据记录表
| 1 | 2 | 3 |
试样质量/g | | | |
加入核黄素标样的量/μg | | | |
样液的初始体积/mL | | | |
测定时分取样液的体积/mL | | | |
试管a（样液加水）的荧光强度 | | | |
试管b（样液加标样）的荧光强度 | | | |
试管c（样液加连二亚硫酸钠）的荧光强度 | | | |
维生素B2含量mg/kg | | | |
维生素B2的平均含量mg/kg | | | |
相对偏差/% | | | |
| | | |
2）计算方法和公式
核黄素（维生素B2）含量以mg／kg（或g／kg）表示，按下式计算：
式中：Aa──试管a（样液加水）的荧光强度；
Ab── 试管b（样液加标样）的荧光强度；
Ac──试管c（样液加连二亚硫酸钠）的荧光强度；
m1──加入核黄素标样的量，μg；
V──样液的初始体积，mL；
V1── 测定时分取样液的体积，mL；
m2──试样质量，g
R── 稀释倍数
3）注意事项
1、（Aa-Ac）／(Ab-Aa)值应在0.66～1.5，否则需调整样液的浓度。
2、平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数3位。
3、同一分析者对同一试样同时或快速连续进行两次测定，所得结果之间的差值在核黄素含量小于或等于5.0mg／kg时，不得超过平均值的15％；在核黄素含量大于5.0mg／kg时，不得超过平均值的10％；在核黄素含量大于50mg／kg时不得超过平均值的5％。
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