RNA Extraction Protocol
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异硫氰酸胍/苯酚法-----目前实验室使用的方法！
✓细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放 auts
✓释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离
2.实验试剂与器材
玻璃钢拍门>电化学传感器2.1实验试剂
RNA提取试剂Trizol（Invitrogen）、氯仿、异丙醇、75%乙醇、无水乙醇、DEPC水，反转录试剂盒（Fermentas），cDNA纯化试剂盒（Promega），末端加尾酶TdT（Thermo）。
2.2实验器材
微量移液器（Eppendorf），电泳仪，电泳槽，超净工作台，4℃低温离心机（Eppendorf），常温离心机（Eppendorf），匀浆机（IKA），高压蒸汽灭菌锅，通风橱，紫外分光光度计（Eppendorf），PCR仪（Takala），剪刀，镊子，0.2mL、1.5mL离心管，头。 3.实验前准备工作
实验前将要用到的试剂配好（75%乙醇：75mL的无水乙醇+25mL的去离子水；DEPC水：在1000ml双蒸水中加入DEPC原液1ml，然后摇匀过夜），与离心管、头、剪刀、镊子（用DEPC水处理过的，浸泡过夜）一起灭菌（126℃，90min），之后剪刀和镊子最好在紫外灯下照射半小时。提前20min打开低温离心机预冷。准备两幅手套，一个口罩，塑胶手套不能离开通风橱，整个实验过程尽量降低外源RNA酶对样品中RNA的降解。 4.实验步骤手术台
4.1取样
（1）组织样品：将组织在RNA保护液中用剪刀剪碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
（2）贴壁培养细胞：不须消化，直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
（3）细胞悬液：300~500g离心10min收集细胞，每5～10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1mlTRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
4.2 RNA提取
（1）匀浆：取50~100mg保存在-80°C或保存在RNA保护液（RNAfixer，百泰克生物公司）中的组织加入800μl Trizol充分匀浆（匀浆机调到4或者5档，一次5s，一共2~3次。匀浆的时候不要贴着管壁，尽量减少泡沫的产生），每次匀浆完一个样品要用沾有75%酒精的纸擦拭匀浆机的钻头。
（2）裂解：加入200μl Trizol，充分剧烈震荡15s，在冰上静置5min；4℃，12000g，离心10min。
（3）分离：将离心后的上清液转移到另一离心管，加入250μl氯仿（动作要快，氯仿见光分解），剧烈震荡30s，室温放置3min；4℃，12000g，离心15min。
（4）沉淀：将离心后的上清液转移到另一离心管（注：切记不要吸到中下层溶液，宁可少吸一些上清），加入500μl预冷的异丙醇（提前在冰上放置），上下颠倒混匀，于-20℃放置15min；4℃，12000g，离心10min，弃异丙醇上清，收集沉淀。
（5）洗盐：在收集的沉淀中加入1ml的75%乙醇（预冷，无RNase，优级纯，RNA提取专用），上下颠倒混匀（4~5次）；4℃，12000g，离心5min，吸出75%乙醇弃去，留下沉淀。
（6）保存：在沉淀中加入1ml无水乙醇，保存于-80℃（一般最多可以保存1个月）。
（7）取出3~5μg（芝麻粒大小）保存于无水乙醇中的RNA，加入30μl DEPC水中，取2μlRNA 用于琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。
（8）取2μlRNA用紫外分光光度计检测其定位板A260值、A260/A280值。纯净的RNA的A260/A280应在1.8~2.2之间。
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