摘要 本实验采用基因组DNA－SDS法提取动物组织细胞基因组DNA，异硫氰酸胍/苯酚法提取拟南芥总RNA并进行RT-PCR，质粒小提试剂盒（离心柱型） 提取质粒DNA并进行外源目的片段的鉴定，同时对所提取的DNA、RNA及质粒DNA进行PCR扩增及电泳。综合学习了生物核酸DNA、RNA的提取方法与原理，并学习、掌握了DNA、RNA的PCR扩增以及凝胶电泳的检测技术。 关键词 DNA RNA PCR 凝胶电泳
引言 核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。
1、DNA提取的几种方法 ：
1.1 CTAB法（植物DNA提取经典方法）
CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子
去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
1.2气模 SDS法
SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸: 如重组质粒的鉴定，DNA酶谱制作等。琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。 2、RNA提取的通用方法
异硫氰酸胍/苯酚法 原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA
3、RT-PCR是指将逆转录(Reverse Transcription；RT)反应和PCR (Polymerase Chain Reaction)反应组合在一起的方法。
PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增倍数可达106。
4、质粒DNA的提取与外源目的片段的鉴定 采用北京天庚高纯度质粒快速提取试剂盒。质粒是独立于染体外的，能自主复制且稳定遗传的因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。质粒具有自主复制、不相容性、多拷贝性、转移性、选择遗传标记、质粒DNA链上有1到几个限制性内切冷凝器设计
酶单一识别位点等特点。它可以独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染体中，他离开宿主细胞就不能存活，而他控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。
材料与方法
（一）动物组织细胞基因组DNA提取及琼脂糖电泳
1 新鲜或冰冻组织处理
取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。将匀浆液转移到1.5ml离心管中。加20% SDS 25μl，蛋白酶K (2mg/ml) 25μl，混匀。65°C水浴30min。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。
2 DNA提取
2.1 加等量的酚/氯仿/异戊醇至上述样品处理液中振荡混匀，离心12000 rpm，5min。
2．2 取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿/异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。
电压互感器柜2.3 取上层溶液至另一管，加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。。
2.4 小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ，10min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。
2.5 加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存备用。
3 DNA及RNA含量测定
3.1 取少量待测DNA(RNA)样品，用TE或蒸馏水稀释20倍（100ul-2ml）。
3.2 用TE或蒸馏水做空白，在260 nm、280 nm、310 nm处调节紫外分光光度计的读数至零。
表面电晕处理机3.3 加入待测DNA(RNA)样品在三个波长处读取OD值。
3.4 纯DNA样品的OD260/OD280 大约为1.8，高于1.8可能有RNA污染，低于1.8有蛋白质
污染；纯RNA 样品的OD260/OD280 大约为2.0。
3.5 根据OD值计算DNA（RNA）浓度或纯度。
[SSDNA]=33×（OD260-OD310）×稀释倍数
[dSDNA]=50×（OD260-OD310）×稀释倍数
[SSRNA]=40×（OD260-OD310）×稀释倍数
4 琼脂糖电泳
4.1 凝胶的制备
以稀释的电泳缓冲液为溶剂，用微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。
4.2 样品配制与加样
DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料
4.3 电泳
低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。因此为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5%时，为增加凝胶硬度，可在4℃进行电泳
4.4 染和拍照
常用荧光染料溴乙锭（EB）染，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。
（二）植物总RNA提取及RT-PCR
1 植物总RNA提取
1.1 取幼叶约250 mg在液氮中研磨至细粉（注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%），转入预冷的1.5 ml离心管； 加入1 ml Trizol提取液震荡摇匀；
1.2 室温放置5 min后，加入0.5 ml的氯仿，剧烈摇动离心管5 min；
1.3 在4℃条件下，12000 rpm离心15 min；
1.4 溶液分为两层，下层氯仿浅红液层，将上层液体移入干净离心管，加入0.5ml异丙醇在15~30℃条件下，沉淀10 min；
1.5 然后在, 2~8℃条件下，12000 rpm离心10 min，RNA沉淀管壁和底部；
1.6 去掉液体部分，加入1 ml 75%酒精洗2次， 4℃下12000 rpm离心10 min。
1.7 小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10 分钟（注意不要干燥过分，否则会降低RNA 的溶解度）。然后将RNA 溶于水中，必要时可65℃水溶 10-15 min。RNA 可进行mRNA 分离，风干后，加入60 µl DEPC处理过的水溶解RNA，储藏于-20℃冰箱备用。
1.8 电话控制器定量：在紫外分光光度计上测定OD260和OD280。
1.9 1.2%琼脂糖电泳检测。
2 RT-PCR
2.1 cDNA的合成
1.在冰浴上制备以下混合液
总RNA
RNA 1 µl
Oligo(dT)18 Primer(0.5µg/µl) 2 µl
2.5mM dNTP Mix 2 µl
RNase-free ddH2O 14.5 µl
轻轻混合并离心3-5sec
2.2 70℃ 5min，并迅速在冰水中冷却2min。加4 µl5xFirst-Strand Buffer;加0.5 µl RNasin.
2.3 制作门窗放置PCR薄壁管在冰上按顺序加1ul TIANScript M-MLV.混匀。
2.4 42℃ 50min
2.5 95℃ 5min停止逆转录反应，反应物保存-20℃或者直接用于PCR
cDNA的PCR
25µl PCR体系的组成：
10×PCRbuffer 2.5 µl
2.5mM dNTP 2 µl
sense primer 1 µl (1umol/l)‘
antisense primer 1 µl (1umol/l)
cDNA 0.2-X µl
Taq 酶 1 µl l(2.4U))
无菌 ddH2O X µl
总体积 25 µl
PCR反应条件：
94 ℃ 5 min
94 ℃ 1 min
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