RACE cDNA反转录说明书
2.0 ul 5×First-Strand Buffer
假牙加工
1.0 ul DTT (20uM)
1.0 ul dNTP Mix (10mM)
总共体积:4ul
2. 准备以下试剂:
5’-RACE-cDNA: 1.0—2.75ul RNA, 1.0ul 5’-CDS Primer A
3’-RACE-cDNA: 1.0—3.75ul RNA, 1.0ul 5’-CDS Primer A
Control-cDNA: 只需要1ul mouse heart total RNA(1ug/ul)
3. 加入H2O于上一步反应液至5’-RACE为3.75ul,3’-RACE为4.75ul,然后轻轻吸打混匀。 4. amadori放入PCR仪反应:72℃ 3min,
42℃ 2min
然后14000g离心10s。
metal dome
5. 对于5’-RACE-cDNA的合成,加入1ul SMARTerⅡA oligo至4.75ul。
6. 配混合液: 4.0ul Buffer mix from step 1
0.25ul RNase inhibitor (40U/ul)
1.0ul SMARTScribe reverse transcriptase (100U)
总体积:5.25ul
7. 家用管道疏通机>三极管自锁电路将第6步混合液加入第2步微离心管中,使总体积达到10ul。用轻轻吸打混匀。
8. 42℃反应90min,然后70℃反应10min。
双联齿轮油泵9. 用Tricine-EDTA buffer稀释反应产物: 如果:起始RNA<200ng,加入20ul;
起始RNA>200ng,加入100ul;
Poly A+ RNA,加入250ul。
10. 将稀释好的cDNA模板保存于-20℃,最长时间达3个月。