cDNA的制备与检测

三通管接头快速插头

cDNA的制备与检测

[实验原理]
手机转轴总RNA，经寡聚(d丁)纤维素亲和层析柱分离出mRNA，以寡聚(d丁)为引物，经反转录合成双链cDNA。先用反转录酶合成第一条cDNA链；经碱降解作用除去RNA模板后用大肠杆菌DNA聚合酶，以第一条链cDNA的3’末端结构为引物合成第二链，最后形成双链cDNA。
[仪器、材料与试剂]
(一)仪器和材料
紫外线透射仪、移液、琼脂糖凝胶电泳系统
(二)试剂
特异引物、逆转录试剂盒
[实验步骤]
（一）cDNA的合成
1、取约9uL mRNA，依次加入：第一链缓冲液4uL，RNA酶抑制剂1 uL，Oligo(dT)引物2uL，dNTP混合液2uL AMV逆转录酶2uL，混匀，离心10min，42℃水浴1h。
2曲柄销、在冰上于第一链反应产物中，加入以下试剂：第二链缓冲液然40uL，RNA酶H 1uL，大肠杆菌DNA聚合酶5uL，DEPC处理过的水至100uL，混匀，离心10s，12℃、22℃、65℃水浴各1h。
3、加入T4DNA聚合酶，振荡混匀后离心10s，37℃水浴10min。
4、加入10uL 200mmol／L EDTA和2ul SDS（10%，W/V）
5、加入80uLTE，20uL 3mol／L醋酸钠，400uL乙醇，-20℃放置15min。
6、15000rpm 离心15min。
7、弃上清，稍晾干至无乙醇味，加球墨铸铁管qiumogg40uLTE溶解沉淀，即为合成的cDNA。
（二）cDNA电泳检测
取约5ul反应产物，在1%番茄加速琼脂糖凝胶上电泳，EB染，紫外灯下检测，呈现出大小在200—10Kb的拖带，其中重心区域小1—4Kb之间，这说明反转录完全，得到了高质量的cDNA。

本文发布于:2024-09-22 06:55:59，感谢您对本站的认可！

本文链接：https://www.17tex.com/tex/1/188719.html

上一篇：cDNA 文库的构建

下一篇：RNA的提取和cDNA合成原理和实验方法

标签：合成转录琼脂糖引物实验

留言与评论（共有 0 条评论）