万寿菊粉 取2 u1提取的紫茎泽兰mRNA，加入适量的CDSIII primer和SMART IV Oligo寡
核苷酸以及其它相应试剂，在适当的条件下，经反转录酶进行反转录合成紫茎泽兰第一链cDNA. 2、LD-PCR合成紫茎泽兰第二链cDNA
取合成的紫茎泽兰第一链cDNA加入其它试剂，通过LD-PCR进行双链cDNA的合成
3、紫茎泽兰双链cDNA的酶切及分离纯化
卡孔双链cDNA经蛋白酶K消化去除DNA聚合酶活性，经氯仿:异戊醇抽提，酒精沉淀后，用限制性内切酶sfi I进行酶切消化。 酶切后，过CHROMA SPIN-400柱进行分级分离纯化，以去除小的片段和杂质，依次收集16管，经1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测后，收集cDNA含量最高的几管。
4、双链cDNA片段的克隆和体外包装
分级分离纯化的双链cDNA，定向克隆到试剂盒提供的经sfi I酶切的去磷酸化的入λTripIEx2载体上，在载体量不变的前提下，设定了3个连接梯度反应，连接结束后，3个连接产物分别用Promega公司的Packagene Lambda DNA受Packaging System包装，体外包装条件按试剂盒说明进行。 5、文库的滴定与重组率检测
用常规方法检查文库的滴度。3个连接反应包装后，分别取1ul用1X Lambda dilution buffer按1:10稀释，稀释后的入噬菌体裂解物再分别取0. 5ul 加入到150ul预先过夜培养的XL1-BLue菌液，在37 C进行20min的吸附后，再加入到1. 5m1熔化的LB/MgSO4顶层软琼脂，迅速混匀倒到预热至37℃的平板上，快速摇动平板使顶层软琼脂分布均匀，顶层软琼脂凝固后在37℃培养箱中倒置培养，每相隔一段时间后，检查噬菌斑生长情况。根据长成的噬菌斑的数目进行文库的滴度计算，公式如下 图像拼接器: 免拆模板
14n
文库的重组率则利用蓝白斑互选进行，在每1. 5m1的顶层琼脂加入50ul X-gal (20mg/ml) , 50ul IPTG (200mg/Ml)，待噬菌斑长成后，统计蓝白斑的数量，算出重组率。
6、 cDNA的PCR快速鉴定
从平皿中直接挑取噬菌斑，用5' PCR primer和3' PCR primer分别进行PCR扩增检查插入片段的长度。
初步结果：按l : 10的比例稀释后滴定，过夜后统计噬菌斑数目并计算滴度。1号和2号连接反应的噬菌斑很少，滴度很低，而3号连接反应的滴度为2.47X106pfu/ml, 滴度很高，符合建库标准。所以3号连接反应的cDNA与载体的比例最理想，连接效率最高。
紫茎泽兰cDNA的PCR快速鉴定，随机挑取10个透明噬菌斑，PCR扩增均有大于
500bp的插入片段，进一步说明已成功获得了紫茎泽兰cDNA重组噬菌体。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议