1。 Superscipt II―RT 合成第一链 :
1。 在一RNase-free的0。2ml PCR管中,加入 xul mRNA(大约500ng)
1ul Xho I Primer（1。4ug/ul)
(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3'）
11—x ul RNase—free water
（大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube）合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。)
2。 混匀后，70℃反应10分钟;
3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;
4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂：
4ul 5×first strand buffer
2ul 0.1M DTT
1ul 10mM dNTP(自己配制)
5。 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II―RT,混匀;
7. 42℃反应50分钟,然后70℃，15分钟灭活反转录酶.
氯化钠是一种重要的化工原料2。 cDNA 第二链的合成 ：
1. 第一链反应完成后，取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega）: 20ul 10×DNA Polymerase I buffer
6ul 10mM dNTP(自己配制）
xul dd H2 O
1ul RNase H（2U/ul)
10ul DNA Polymerase I（10U/ul）
总体系为200ul;
铝塑分离2. 混匀后，16℃反应2。5小时；
3. 70℃灭活10分钟；
4。 反应完成后，得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上；
j biol chem5．取2ul二链产物,同保存的一链产物一起电泳鉴定.同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。
化工复合软管注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。
3. 双链 cDNA 末端补平 ：
1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega)：
6ul 10mM dNTP
2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)
2ul BSA（10mg/ml）
新型高效台车式退火炉2. 稍微离心混匀反应物， 37℃反应至少30分钟，然后75℃灭活10分钟；
3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;
4. 离心后,吸取上清于另一1。5ml eppendof管中,加入等体积氯仿，上下颠倒几次混匀后，常温下13000g离心5分钟；
5。 吸取上清至另一eppendof管，加入1/10V3M NaAc(PH5.2）和2。5V预冷的无水乙醇，
混匀,—20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;
6。 第二日,将昨日沉淀物在4℃，13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
7.离心完毕,弃上清，加入1ml 70％乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟；
8.离心完毕,弃上清，干燥沉淀至无乙醇气味。
注:第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。
PCR纯化试剂盒操作流程：
1．溶液PE使用前应加入适量体积95％－100％的乙醇,混匀。
2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀.
3．加入spin column中,13000rpm离心1min。
4．加入0。75ml buffer PE，13000rpm离心1min.
5．13000rpm,再离心1min。
6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。
7．13000rpm离心2min。
8．加入30ul buffer EB,静置10min。
9．13000rpm离心2min。
10．加入1/10体积3M的NaAc，2。5倍体积无水乙醇,混匀，－20℃沉淀过夜。
4 EcoR I adaptor 加接 ：
1。 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul），4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;
2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂：
1。2ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul）
3。 混匀后,4℃连接3days，或者8℃过夜连接;
5 双链 cDNA 末端的磷酸化及 Xho I 酶切 :
1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase;立式干粉搅拌机
2. 稍微离心使反应物集中至管底，室温下放置5分钟,然后加入下列试剂：
1ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
6ul dd H2 O
1ul T4 PNK（10U/ul)
3。 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;
4. 稍微离心使反应物集中至管底;
5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂：
4ul Xho 10×Buffer
2ul BSA
5ul ddH2O
8ul Xho I （10U/ul）
6。 37℃反应1.5小时，然后65℃灭活酶10分钟;
7. 反应完成,双链cDNA合成完毕.置于4℃准备回收。
6。 胶回收 cDNA(QIAEXII GEL Extraction Kit 回收试剂盒 ）
1．配制小胶数板（每个样品一板）：1％琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml 胶
2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。
3．电泳50V；1hr
4．紫外灯下分别切下500～1kb、1。0—2。0kb及2。0-4.0kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。
5．称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI）
6．50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入5ul QIAEXII
7．50℃ 水浴10min，每隔2min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮
8．4℃，13000rpm,30sec。(弃上清，离心机中甩一下,吸取上清）
9．加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬
10． 离心并去上清（同操作8）
11． 加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec,去上清
12． 再加入500ul buffer PE,重悬QIAEX II,离心30sec，弃上清，离心机中甩一下,吸去上清
13． 超净台上吹干（至无乙醇味）,加入10ul elution buffer，重悬QIAEX II,静置5min，13000rpm，30sec。吸上清,冰上放置。
14． 取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder)及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。
15． 将收回的cDNA置于—20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。
注意事项：
1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。
2．胶回收时电压要稳定。
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