用PCR技术从cDNA文库中获取目的基因长片段.

◇实验方法学◇

用PCR技术从cD NA文库中获取目的基因长片段3

汪思应　郑　红　程　洁　余科科　许望翔1　李　俊23

艾灸净化器(安徽医科大学病理生理学教研室、2临床药理研究所,合肥　230032

摘要　目的　建立一种简便有效的获取cDNA大片段的实验技术。方法　应用PCR原理,设计特异引物结合文库载体引物对大鼠胎肝cDNA文库进行PCR扩增;用随机引物标记法标记已知小片段“目的基因”(300bp±作为探针,对PCR产物进行S orthern杂交以检验“目的基因”片段的正确性及长度;回收“目的基因”片段并连接入PGEM2T载体,转染J M109并扩增后,提取“目的基因”测序。结果　琼脂糖凝胶电泳发现PCR扩增产物有多条不同长度的段,S orthern杂交发现一段长度为115kb的cDNA片段为“目的基因”;测序结果与G eneBank进行Blaste分析,该基因为一株新的序列,已在G eneBank中登录注册(Rat Liver Regeneration2related Pro2 tein1,RL RP21AF236054。结论　应用PCR结合S orthern 杂交等手段可迅速从cDNA文库中获取长片段目的基因。

关键词　基因;实验方法;PCR

随着分子生物学研究的发展,人们已建立了多种方法来获取“目的基因”。但传统的菌落杂交筛库技术操作繁琐、耗时长且可靠性不高[1];多种获取cDNA的试剂盒价格昂贵且有时需特殊仪器,因此我室利用简单的PCR技术从cDNA文

3国家自然科学基金(39670366及安徽省自然科学基金(00044202 1军事医学科学院,北京　100850

3通讯作者库中获取“目的基因”大片段。并用已知小片段目的基因作为探针来鉴定PCR产物以确保实验结果的正确。现报道如下。1　材料与方法

1.1　材料　Wistar大鼠购自军事医学科学院动物中心;大鼠胎肝cDNA文库购自Clonetech公司;探针标记试剂盒购自Promega公司;α232P(dCTP购自北京亚辉放射生物公司;PCR 试剂购自宝生物(大连公司。

1.2　目的基因小片段的获取　用RDA(表达性差异显示分析,representational difference analysis,RDA技术筛选正常大鼠肝与再生肝差异表达基因并建立差显EST文库,随机挑选53

个重组子测序并用DNAtools,BLAST等软件进行生物学信息分析。其中有10个序列在G enebank中无明显同源性发现。再用Slot Blotting,Northern Blotting验证,获得了几个与肝再生可能相关的新的小片段基因(300~500bp[2]。

1.3　PCR设计　根据已知小片段基因序列设计正反向引物,并与cDNA文库中载体引物T7/SP6分别配对。以大鼠胎肝cDNA文库为模板进行PCR,PCR产物经琼脂糖凝胶分析,凝胶成像仪扫描成像。

目的基因PCR引物:

P15′2A GTGCTA TTGTG ACCA TCAA G A TG23′

P25′2TTCTGGTCACTCCACA TCA GCTCT23′飞行棋棋盘

文库载体插入片段两端引物:

T75′2A TTA TGCTG A GTG A TA TCCC23′

SP65′2TAAA TCCACTGTG A TA TCTT23′

胆囊切除、瘘口直接修补、T管引流术:本组Ⅱ型10例,瘘口较小(<肝总管周径1/3,逆行切除胆囊,肝总管瘘口用3~0无损伤缝线直接缝合关闭,瘘口处有较厚瘢痕时应予修理再缝,于瘘口下方置T管引流3~6mon不等,无并发症发生。注意T管不能放置在瘘口内,否则,易发生晚期的胆道狭窄。遇胆囊萎缩,宜剖开胆囊,吸净胆汁,取出结石,用细小号探子,探明胆道做到心中有数,以左手食指衬在胆囊内,紧贴胆囊剥离切除胆囊。发生胆瘘1例,持续负压引流痊愈。重复数据删除

胆囊切除+胆囊壁补片修补+T管引流术:3例Ⅲ型患者,采用此术式,1例术后发生胆漏,保守痊愈。利用胆囊壁补片修补瘘口,其优点是组织结构相似,要保证补片有良好的血供,缝合要保证无张力和缝合严密,T形管要在瘘口下方的胆总管上另开口置入,短臂超过胆囊胆管瘘,置管3~6 mon。如果术中估计不足未留胆囊瓣,可以用肝圆韧带或带血管蒂的空肠片修补。

对Mirizzi综合征Ⅳ型者或肝总管损害大于1/2的,直接缝合和补片修补会引起胆管狭窄,应行空肠肝管Roux2Y吻合。Mirizzi综合征一般视为腹腔镜胆囊切除术的禁忌证,近两年,随着腹腔镜手术技术水平不断提高,也可见Mirizzi综合征经腹腔镜胆囊切除术的报道〔4〕。

参考文献

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l6562

1　Csendes A,Carlos J,Burdiles P et al.Mirizzi syndrome and chole2 cystobiliary fistula:A unifying classification.By J S urg,1989;76

(11:1139

2　沈世鹏,萧蓉葆编著.胆石病.第1版,北京:人民卫生出版社, 2000;1:106~9

3　Mcsherry CK,Ferstenberg H,Virshup M.The Mirizzi syndrome: Suggested classification and Surgical therapy.S urg Gast roenterol, 1982;1:219

4　李际辉,郑成竹,仇　明et al.Mirizzi综合征的腹腔镜.中国实用外科杂志,2000;20(12:727~8

・

・安徽医药　A nhui Medical and Pharm aceutical Journal　2003Feb;7(1

实验原理示意图

:汽水取样

1.4　同位素探针标记　详见Promega 公司探针标记试剂盒说明书:取小片段“目的基因”

(cDNA 150ng ,加无核酸酶水至15μl ,100℃变性5min ,立即置冰,分别加入Promega 探针

标记试剂:5XLabeling buffer 5μl 、BSA 1μl 、dN TP mix 1μl 、

p 2dCTP 215μl 、T αK αR αK enown Ⅰ015μl 。室温(25℃

反应1h ,用Sephdex G 250柱纯化后,-20℃储存备用。

本文发布于:2024-09-23 10:15:22，感谢您对本站的认可！

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