免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。将含有目标蛋白(抗原)的样品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或非变性电泳(Native-PAGE)等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。例如，将经SDS-PAGE分离的蛋白质带转移到膜上后，膜用封闭液处理，然后与第一抗体反应，膜经漂洗后再与偶有辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸(酯)酶(AP)的第二抗体反应，加人生底物反应之后，即可显示出目标蛋白的位置。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，其优点是方法简便、标本可长期保存、结果便于比较，故广泛应用于分子生物学等领域，成为免疫学、微生物学及其他生命科学常用的一种研究方法。 试剂：
1、蛋白提取试剂（RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA）， PMSF（每克组织30ml，10 mg/ml PMSF））
2、NC膜或PVDF膜
车辆检测系统3、丽春红，考马斯亮蓝
4、Western Blot试剂盒
实验步骤
1. 取细胞。
2. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA）， PMSF（每克组织30ml，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃
3. 加入PMSF（每克组织30ml，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟
4. 移入离心管4℃ 约20,000 g（约15,000转）15分钟
5. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存
6. 进行Bradford比法测定蛋白质浓度
7. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液
8. 沸水浴中3分钟
9. 上样
10. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）
11. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）
12. 膜用丽春红染，胶用考马斯亮蓝染
13. Westernblot 试剂盒显
14. 分析比较记录
一.试剂选择
pppd2481. 膜的选择：主要采用 NC膜和PVDF膜，其比较如下:
NC膜 PVDF膜
ca3780物理强度 差 好
蛋白质结合能力 80-100ug/cm2 100-200ug/cm2
溶剂耐受力 无 有
考马斯亮兰染 否 可以
ECL检测 否 可以
快速免疫检测 否 可以
动力电池模拟电源
SDS存在下蛋白质结合 差 好
质谱分析 否 可以
(尼龙膜和NC膜的特点相似，主要用于核酸杂交)
2.膜的孔径: 0.45um适用一般蛋白质. 0.2um适用小分子蛋白质.
3.蛋白质染
Ponceau-S Red丽春红 5ug 无
快绿Fc 5ug 无
Sypro Rose 1-2ng 无
氨基黑10B 1ug 有
存档文件
考马斯亮兰R-250 500ng 有
印度墨 100ng 有
铝合金箱体胶体金 4ng 有
4. 封闭液:
这一步会影响结果的成败和背景的强度（快速免疫检测法无需封闭液）。常用封闭液为BSA和Tween20. 脱脂干奶粉不适合用于糖蛋白和生物素标记抗体.
5.
一抗: 根据目的蛋白质选择.单抗或多抗均可.注意已变性蛋白质无法检测，必须采用非变性胶电泳.
6.标记二抗: 根据一抗的来源选择二抗.
二.方法选择
1. 显法: 常用底物为BCIP/NBT或DAB .此法简单，但灵敏度不高，并难以从膜上去除.
2. 放射性标记法: 此法灵敏度较高，但同位素比较危险.
3. 化学发光法: 目前比较常用的方法.灵敏度较高，检测时可采用X光胶片或CCD成像系统.
三.快速免疫检测法
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