第6期，第1400－1408页Genomics and Applied Biology,2016,Vol.35,No.6,1400－1408
Research Report
利用CRISPR /Cas9构建稳定遗传的斑马鱼WHSC1L1纯合突变体 陈韵如王湘秀李绍娟刘桂芬*
同济大学生命科学与技术学院，上海,200092*通讯作者,gfliu0806@tongji.edu
摘
要
本研究以斑马鱼为研究对象，成功构建组蛋白甲基化酶WHSC1L1基因敲除的纯合突变体，为研究
2-氯-5-甲基吡啶
WHSC1L1在胚胎发育早期组蛋白甲基化修饰的影响提供模型。
采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，通过crispr.dfci.harvard.edu /SSC /和crispr.mit.edu /网站分别对靶位点序列特征和脱靶可能性打分，设计高活性的single-guide RNA (sgRNA)，通过TA 克隆测序检测到F 0突变效率高达75%，通过F 0代雌雄交配，对得到13条F 1代成体进行逐一剪尾鳍鉴定基因型，得到6条WHSC1L1基因缺陷的纯合突变体，6条纯合体均为同一种突变类型，且突变类型为移码突变。通过设计高效率的sgRNA 可以直接通过F 0代雌雄交配获
得纯合突变体，省去了F 0代与野生型交配确定突变率的步骤。本研究得到WHSC1L1基因缺陷的纯合体，为
研究胚胎发育过程中由此基因突变引起的组蛋白甲基化修饰变化对胚胎发育的影响及机制提供了有力的帮助。关键词斑马鱼,WHSC1L1基因,CRISPR /Cas9，纯合突变体
Construction of Zebrafish WHSC1L1Homozygous Mutant Using CRISPR /Cas9
Chen Yunru
Wang Xiangxiu
Li Shaojuan
Liu Guifen *
School of Life Sciences and Technology,Tongji University,Shanghai,200092*Corresponding author,gfliu0806@tongji.edu DOI:10.13417/j.gab.035.001400
Abstract In this research,we chose zebrafish as our model organism and constructed histone-lysine N-methyltransferase WHSC1L1homozygous mutant which was helpful to explore change of histone methylation caused by WHSC1L1knock-out during early embryo development using CRISPR /Cas9system.We designed high activity sgRNAs using crispr.dfci.harvard.edu /SSC /and crispr.mit.edu /websites calculating sequence features and off-target influence,respectively.The mutate rate can reach up to 75%detected through TA clone and Sanger sequencing.We got 13F 1which were acquired through injected F 0adults in-cross.After detection of mutation type through cutting the tail,we acquired 6frameshift WHSC1L1gene knock-out homozygous mutants shared the same mutation type.We can easily acquire homozygous mutant through designing high activity sgRNAs which can save the step of outcross used for each F 0mutation rate detection.The mutant we constructed is helpful to explore changes caused after variations of histone methylation and internal mechanism during zebrafish embryo development.
Keywords Zebrafish,WHSC1L1gene,CRISPR /Cas9,Homozygous mutant 基金项目：本研究由国家自然科学基金(31371288)资助
WHSC1L1(wolf-Hirschhorn syndrome candidate 1－like 1)又名NSD3，是Wolf-Hirschhorn 综合征相关基因，位于人染体8p11.2(Stec et al.,2001)。WH －SC1L1基因是NSD (nuclear receptor Su (var)3－9,en-hancer-of-zeste and trithorax (SET)domain-containing)
家族成员之一。NSD 家族含有三个成员：NSD1、
NSD2(WHSC1)、NSD3(WHSC1L1)，
它们共同含有的结构域有：SET 、PWWP 和PHD ，其中SET 结构域具有赖氨酸甲基化催化活性。WHSC1L 包含三种异构体：NSD3-long ，NSD3-short 和whistle (Angrand et al.,
基因组学与应用生物学Genomics and Applied Biology
2001;Kim et al.,2006)，其中，NSD-short不含SET结构域，只有可以识别并且结合在组蛋白H3N末端的PWWP结构域。急性髓系白血病细胞(acute myeloid leukemia)中发现NSD-short通过PWWP结构域识别甲基化H3K36位点，作为连接BRD4和CHD8的中间蛋白，形成BRD4-NSD-short-CHD8复合物，该复合物结合在基因的启动子区域，激活基因转录，进而维持癌细胞无限增殖。通过加入BRD4蛋白的BET (bromodomain and extraterminal)结构域抑制剂可以阻止BRD4-NSD-short-CHD8复合物结合在基因启动子区域，进而达到抑制癌细胞增殖的作用。whistle 含有SET结构域，具有组蛋白甲基化催 化活性。组蛋白的甲基化修饰与真核生物基因的转录调控相关，whistle通过二甲基化H3K4(H3K4me2)，H3K27 (H3K27me2)抑制基因转录(Kim et al.,2006)。同时，SET结构域可以催化H3K36二甲基化(H3K36me2)。转录活跃的基因3'端富集大量的组蛋白H3K36me3修饰，表明组蛋白H3K36me3可能与基因的转录激活相关，这表明NSD3在基因转录调控中扮演双重角。Kim通过研究SMYD3和SETD7两个H3K4甲基化酶发现斑马鱼胚胎发育过程中H3K4甲基化异常会影响心脏发育(Kim et al.,2015)。胚胎发育过程中组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)缺失严重影响后侧线原基的发育(He et al.,2015)。同时，早期胚胎发育MZT(maternal to zygotic transition)时期，转录起始位点(transcription start sites,TSS)出现核小体的规律性排布，并且在这些位点出现H3K4me3修饰，表明组蛋白修饰在早期胚胎发育过程中起着关键作用(Zhang et al.,2014)。有研究发现NSD-long通过甲基化H3K36促进神经嵴的发育和迁移(Jacques-Fricke and Gammill,2014)。到目前为止，WHSC1L1在胚胎发育过程中的作用尚未报道。
斑马鱼的基因组与人类的基因组相似度高达85%，斑马鱼体内同样存在WHSC1L1基因，并且具有与人类基因完全一致的结构域。斑马鱼与小鼠相比，具有更高的繁殖能力，同时胚胎发育时间短，发育过程中胚胎透明，易于观察表型缺陷和进行基因筛选。目前在斑马鱼中最常用的研究方法是通过抑制基因的功能包括胚胎注射Morpholino，RNAi (RNA interference)、ZFNs(zinc finger nuclease)、TAL-ENs(transcription activator-like(TAL)effector nucle-ases)和CRISPR/Cas9基因敲除技术研究表型缺陷
和下游基因的表达情况。其中Morpholino成本高，同时有报道称Morpholino和RNAi有严重的脱靶效应(Sch Lte-Merker and Stainier,2011;Kelly and Hurl-stone,2014)。ZFNs和TALENs技术设计繁琐，花费时间长，并且突变效率低。CRISPR/Cas9技术突变效率高，同时在斑马鱼体内造成的脱靶效率低，脱靶位点的突变在传代中逐渐被稀释，为斑马鱼作为模式生物的广泛应用提供了有力的帮助。最近的研究发现CRISPR/Cas9技术造成的突变高达75%~99%，表明大多数细胞中两个等位基因都发生突变，通过F
0代雌雄鱼交配可以得到纯合突变体。由此，我们以斑马鱼为模式生物，利用CRISPR/Cas9技术针对三种异构体的共有结构域，设计靶位点，TA克隆检测到F0代突变效率高达75%。最终，通过F0代雌雄鱼交配得到稳定遗传的WHSC1L1基因敲除的纯合突变体。为研究WHSC1L1在胚胎发育中的作用提供了有力的帮助。
1结果与分析
1.1通过CRISPR/Cas9系统成功编辑斑马鱼WH-SC1L1基因
实验流程(图1A)。收集注射后胚胎(F
代)，裂解后通过PCR得到一段包含两个突变位点的PCR产物，送至金唯智公司做一代测序，测序后
峰图在tar-get－1PAM前4bp出现套峰(图2)。为进一步确认靶位点突变类型，取PCR产物做TA克隆，测序结果显示挑取的4个白菌落中有3个在target－1位点有突变，突变效率高达75%。其中有两种突变类型：一种缺失6个碱基，没有发生移码突变，另一种缺失14个碱基，发生移码突变。然而，4条PCR产物在target－2位点均没有突变(图3)，表明target－1sgRNA 活性高于target－2sgRNA的活性。
1.2通过CRISPR/Cas9系统得到稳定遗传的WH-SC1L1基因敲除的斑马鱼品系
由于WHSC1L1基因是母源基因，因此为了研究WHSC1L1基因对斑马鱼早期胚胎发育的作用，需要去除母源mRNA，为此，我们需要构建WHSC1L1基因的纯合突变体，这样由纯合突变的雌雄鱼交配得到的胚胎在发育过程中缺失WHSC1L1mRNA的影响。实验流程(图1B)。将同一批注射了sgRNA的斑马鱼胚胎恒温28.5℃培养约2.5个月至性成熟，从中取五对鱼雌雄交配，分别收集每对斑马鱼产生的胚胎，恒温培养至24h，PCR后分别做TA克隆测序，检测胚胎突变效率。配对的五对鱼只有一对产胚胎，收集胚胎，利用TA克隆检测突变效率。挑取8个白菌落测序后均有突变，且为同一种突变类型(图4A)。
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图2一代测序检测F 0代靶位点突变效率
Figure 2Mutation ratio of F 0detected by Sanger
sequencing
柴油车尾气处理
图1基因敲除的纯合突变体构建流程Figure 1Overview of mutagenesis strategies
将同一批20枚胚胎恒温培养至3个月，最终13条存活。剪尾鳍鉴定每条成鱼基因型，其中有6条突变纯合体，4条杂合体，6条野生型。每种基因型测序结果及峰图(图4B)，6条纯合突变体基因型一致，均
在PAM 位点前缺失5个碱基，峰图整齐，没有出现杂峰，表明两个等位基因突变类型一致。杂合突变体峰图在PAM 位点后出现双峰，分析每个位点出现的两个套峰，我们得到每个等位基因的序列，其中一个等位基因序列为：5'－CCCTCGCCTGGTTCCCTCCAA
C －3'，另外一个等位基因序列为：5'－CCCTGGTTCC
TCCCAAC －3'，表明其中一个等位基因没有发生突变，另外一个等位基因缺失CGCCT 5个碱基，突变类型与纯合突变体突变类型一致。我们观察到得到的F 1代突变体突变类型不同于F 0代检测到的突变类型，并且突变类型单一。1.3WHSC1L1基因敲除对下游基因的影响
WHSC1L1在迁移前和迁移中的神经髓细胞中
利用CRISPR /Cas9构建稳定遗传的斑马鱼WHSC1L1纯合突变体
Construction of Zebrafish WHSC1L1Homozygous Mutant Using CRISPR /Cas9
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基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
图3TA 克隆方法检测两个靶位点突变比率
Figure 3Mutation ratio of two sgRNAs detected by TA clone and Sanger
sequencing
图4F 1代突变比率检测及成体基因型鉴定流程
Figure 4Overview of mutation ratio of F 1and genotype
identification
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特异性表达，并且调控神经嵴关键转录因子Msx1a 和Sox10神经板基因的表达(Jacques-Fricke and Gam-mill,2014)。我们收取24h WT 和WHSC1L1基因敲除的斑马鱼胚胎，提取总RNA ，经反转录为cDNA 做qPCR ，发现WHSC1L1基因敲除后，Msx1a mR-NA 表达量显著降低，Sox10mRNA 表达量显著升高(图5)。
图5WHSC1L1基因敲除的纯合突变体中Msx1a 和Sox10表达量
Figure 5Expression of Msx1a and Sox10in WHSC1L1gene
knock-out homozygous
mutant
2讨论
本实验得到的F 0代突变效率高达75%，
通过F 0代雌雄交配得到后代纯合突变体的比例接近50%。然而，
不同的sgRNA 在斑马鱼中的突变效率有很大区别。到同轴电缆接头
目前为止，有大量关于影响sgRNA 活性的研究报道，
这些研究集中在20bp 靶位点序列和PAM 位点周围
序列特异性(Wang et al.,2014;Doench et al.,2014;Xu
et al.,2015)，靶位点DNA 甲基化、核小体定位的影响、
靶位点周围染质开放程度等表观遗传特征(Wu et al.,
2014;Kuscu et al.,2014;Hinz et al.,2015;Chari et al.,2015)。目前多项研究证实靶位点和PAM 周围序
列会影响CRISPR /Cas9系统的突变效率。我们利用crispr.dfci.harvard.edu /SSC /和crispr.mit.edu /分别对候选靶位点序列特征和脱靶效应打分，最终筛选出两个靶位点设计sgRNA ，然而两者活性相差非常大，TA 克隆检测的F 0代突变位点位于target －1。因此，除了靶序列和脱靶效应还有其他关键因素影响sgRNA 的活性。实验过程中我们发现，注射细胞造成的突变效率高于注射卵黄的突变效率，这个现象可能是由于注射细胞的剂量高，但同时死亡率会上升。之前研究报道
称靶位点序列长度为20bp ，因为T7转录需要转录起
始位点为G ，设计合成转录模板引物时在20bp 靶位点前面加一个G ，这样突变效率会受到很大影响。目前很多研究发现，设计19bp 靶位点，前面加一个G 同样能够得到较高的突变效率，这样大大减少了靶位点设计的限制(Xu et al.,2015;Moreno-Mateos et al.,2015)。本实验利用这个方法设计靶位点，最终检测到target －1的sgRNA 活性很高，突变效率达75%。观察最终得到的斑马鱼F 1代基因型，只有一种突变类型，且不同于F 0代中检测到两种突变类型。同很多研究发现一样，F 0检测到的突变类型有很多，但是最终得到的F 1代纯合突变体突变类型单一，我们猜测突变应该发生在胚胎发育较早时期。有研究发现斑马鱼胚胎发育到1K 时期有四个生殖细胞，之后生殖细胞开始分裂。如果突变发生在这个时期左右可以解释我们之前发现的现象，1K 时期生殖细胞数量比体细胞数量少，生殖细胞从1K 细胞期开始分裂，分裂过程中突变类型一样，因此突变类型非常少。然而有研究发现在斑马鱼一细胞期注射sgRNA 和Cas9编码的mRNA ，最早在6h 检测到基因
突变，在1K (3h)细胞期之后。这个结论可能跟检测方
法有关(Auer et al.,2014)。文中用T7E Ⅰ内切酶检测方法，T7E Ⅰ倾向于检测大段DNA 缺失的位点，对于几
个碱基的缺失或替换检测灵敏度低(Vouillot et al.,
2015)。目前针对斑马鱼突变效率的检测方法有T7E Ⅰ、surveyor 、限制性内切酶、TA 克隆、二代测序、q-PCR 等方法，我们在实验中常用的方法包括限制性内切酶检
测和TA 克隆测序法。然而，使用限制性内切酶检测突
变效率需要设计在NGG 附近有酶切位点的靶序列，这
样很大程度限制了靶位点的选择。本研究采用TA 克隆
法检测靶位点突变效率。
本实验通过CRISPR /Cas9系统成功获得WH －
SC1L1基因缺失的突变体，
并且在mRNA 水平检测到WHSC1L1下游基因Sox10表达量升高，
Msx1a 表达量降低。此外，
我们可以收集胚胎做ChIP-seq ，观察在胚胎发育过程中WHSC1L1基因缺失引起的组蛋白甲基化变化对胚胎发育的影响，包括可能产生的表型缺陷等。造血系统恶性肿瘤细胞系(hematologic malignan-cies)whistle 转录本和蛋白含量明显升高(Kim et al.,2006)。一少部分患有急性髓系白细胞病人的细胞中出现核孔蛋白98kD (nuclear pore protein 98kD,NUP98)
NUP98和WHSC1L1染体易位，
两者形成NUP98和WHSC1L1的融合蛋白(Angrand et al.,2001)。除造血系统恶性肿瘤细胞系，乳腺癌细胞(breast carcinomas)、肺
癌细胞(lung carcinomas)等肿瘤细胞中均发现WHS
利用CRISPR /Cas9构建稳定遗传的斑马鱼WHSC1L1纯合突变体
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1404地面数字电视接收机
连供系统基因组学与应用生物学
强电井Genomics and Applied Biology
C1L1蛋白含量升高(Taketani et al.,2009;Zhou et al.,2010)，表明WHSC1L1基因与肿瘤发生有关。然而，有研究发现小鼠体内，WHSC1L1基因失活与KRAS 基因共同作用诱导胰腺癌的发生。因此，WHSC1L1在肿瘤发生中的作用机制较为复杂。WHSC1L1基因敲除的纯合突变体有望成为肿瘤研究模型，为临床靶向药物的研究提供帮助。
3材料与方法
3.1实验验材料
野生型斑马鱼：Tuebingen ，sgRNA 转录模板上下游引物(金唯智公司合成)，sgRNA 体外转录试剂盒：MAGAscript 誖T7Transcription Kit (ThermoFisher，货号AM1333)。pGH-T7－zCas9质粒(曹莹老师试验室提供)，Cas9体外转录试剂盒mMESSAGEmMACHINE 誖T7Transcription Kit (ThermoFisher，货号AM1344)。质粒抽提试剂盒：QIAGEN Plasmid Maxi Kit (QIAGEN,12163)。Cas9mRNA 纯化试剂盒：RNA Clean &Con-centrator －5(Zymo Research,R1015)。PCR 反应：LA Taq DNA Polymerase (TaKaRa,RR002A)；Phusion DNA polymerase (Life Technologies,F530S)。3.2靶位点设计
在NCBI 的GenBank 数据库中到WHSC1L1
在斑马鱼中对应的蛋白结构域的序列，选取三个异构体共同的结构域：WHSC1-related ，根据这段结构域所在的位点到对应的蛋白序列，通过USCS-blat 到对应的DNA 序列。利用crispr.dfci.harvard.edu /SSC /和crispr.mit.edu /网站设计分值高的靶序列(Hsu et al.,2013;Xu et al.,2015)。最终筛选出两条19bp 靶序列(表1)。3.3转录模板合成
T7转录酶需要转录起始位点为G ，我们用crispr.dfci.harvard.edu /SSC /和crispr.mit.
注：序列分值通过crispr.dfci.harvard.edu /SSC /网站计算，脱靶分值通过crispr.mit.edu /计算
Note:Sequence score was calculated using crispr.dfci.harvard.edu /SSC /,off-target score was calculated using crispr.mit.edu /
表1靶位点序列和分值
Table 1Target site sequence and score 靶位点名称Target name Target －1Target －2
靶位点序列(5'－3')Target sequence (5'－3')
GTTGGAGGGAACCAGGCGA_GGG AGCGATAAGAACTTTGCAG_AGG
DNA 链DNA strand -+
序列分值Sequence score 1.08130.9168
脱靶分值Off-target score 9582
edu /网站设计19bp 靶位点，合成上游引物时前面
加一个G 。我们合成的两条有互补序列的寡聚核苷酸链，经过PCR 合成sgRNA 转录模板，上游引物序列包含T7结合位点，20bp 靶序列位点和20bp 与下游引物互补配对的序列。上游引物序列：5'－AAT TAATACGACTCACTATA (GN19)GTTTTAGAGCT AGAAATAGC －3'。(N19)指sgRNA 识别DNA 的靶序列，不包含NGG 位点。下游引物包含RNA 环状结构序列，Cas9通过识别sgRNA 环状结构结合在靶序列位点。下游引物序列：5'－GATCCGCACCGACTCGGT CCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTA TTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC －3'。最终合成的sgRNA 模板序列为：AATTAATACGACTC ACTATA (GN19)GTTTTAGAGCTAGAAATAGCA AGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGA AAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCGGATC －3'。PCR 反应体系包括7.75μL H 2O ，5μL Phusion H
F Buffer ，2μL mmol /L dNTP ，5μL 上游引物(10μmol /L，金唯智公司合成)，5μL 下游引物和0.25μL Phusion DNA Polymerase (Life Technologies,F530S)。反应程序：95℃30s ；95℃10s ，60℃10s ，72℃10s ，共40个循环；72℃5min 。PCR 产物用柱子纯化(QIAquick PCR Purifica-tion Kit,QIAGEN,28104)。纯化产物经Nanodrop 定量和纯度检测后，作为sgRNA 体外转录模板。3.4sgRNA 和Cas9编码的mRNA 体外转录对于sgRNA 体外转录，使用1μg 模板做体外转录(MEGAshortscript T7,Life Technologies,AM1354)，得到的转录产物用酚氯仿抽提。对于Cas9编码的mRNA 体外转录，我们使用pGH-T7－zCas9质粒，用Xb Ⅰ线性化后(TaKaRa,1093A)用柱子纯化(QIAquick PCR Purification Kit,QIAGEN,28104)。取1μg 用于体外转录(mMESSAGE mMACHINE T7,Life Tech-nologies,AM1344)，得到的mRNA 用柱子纯化(Zy-mo Research,R1016)。所有纯化后产物用Nanodrop
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