利⽤_Red重组系统敲除⿏伤寒沙门⽒菌sopB基因_李晔 t恤转印纸研究报告?
⽣物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2014年第9期
收稿⽇期： 2014-04-29基⾦项⽬：国家⾃然科学基⾦项⽬（81101220），天津市应⽤基础与前沿研究计划项⽬
（12JCQNJC08100），“ ⼗⼆五”天津市中青年⾻⼲创
新⼈才⽀持计划，天津市创新团队建设项⽬（TD12-5049）
作者简介：李晔，⼥，硕⼠研究⽣，研究⽅向：微⽣物与发酵；E -mail ：******************通讯作者：阮海华，博⼠，副教授，研究⽅向：病原微⽣物与基因⼯程；E -mail ：*******************
利⽤λRed 重组系统敲除⿏伤寒沙门⽒菌sopB 基因电位器旋钮
李晔1 张西轩1 郭梦征2 王素英1 张坤⽣1 阮海华1
（1. 天津商业⼤学⽣物技术与⾷品科学学院天津市⾷品⽣物技术重点实验室, 天津 300134；
2. 中国医学科学院放射医学研究所, 天津 300192）
摘要：利⽤λRed 重组系统敲除⿏伤寒沙门⽒菌LT2的（Salmonella enterica serovar typhimurium LT2，S. typhimurium稀油润滑
LT2）sopB 基因。以pKD4质粒为模板，扩增得到中间带有卡那霉素抗性基因且两端各带有59 bp 分别与sopB 基因上下游序列同源的同源打靶⽚段，将其转化⾄表达Red 重组酶的S. typhimurium LT2感受态细胞中；在抗⽣素压⼒和λRed 重组系统帮助下，同源⽚段和菌体sopB 基因发⽣同源重组，通过卡那霉素筛选得到带有抗性标记的阳性重组菌；转⼊重组酶表达质粒pCP20以除去抗性标记，得到保留单⼀FRT 位点的突变菌株；利⽤PCR 技术鉴定重组菌，并通过检测沙门⽒菌效应蛋⽩SopB 的分泌以及沙门⽒菌感染HeLa 细胞后pAKT 的激活反应来鉴定sopB 基因是否被敲除。构建的ΔsopB 突变菌株失去了分泌SopB 蛋⽩的能⼒，且不能够像野⽣型菌株那样在感染HeLa 细胞的过程中激活pAkt。本研究获得了S. typhimurium LT2的 sopB 基因缺失突变株，为沙门⽒菌感染宿主过程中SopB 的功能研究提供⼯具，同时也为进⼀步探索其他类型细菌的基因敲除提供了线索。 关键词：⿏伤寒沙门⽒菌LT2 λRed 重组系统 sopB 基因敲除同源重组
Deletion of sopB Gene of Salmonella typhimurium LT2 by λRed
Recombination System
Li Ye 1 Zhang Xixuan 1 Guo Mengzheng 2 Wang Suying 1 Zhang Kunsheng 1 Ruan Haihua 1
（1. Tianjin Key Laboratory of Food Science and Biotechnology ，College of Biotechnology and Food Science ，Tianjin University of Commerce ，
Tianjin 300134；2. Institute of Radiation Medicine ，Chinese Academy of Medical Sciences and
Peking Union Medical College ，Tianjin 300192）
Abstract : In order to investigate the role of SopB effector secreted by Salmonella typhimurium LT2, the sopB gene deletion mutant with λ Red recombination system was constructed. To amplify the homologous fragment for sopB deletion, a pair of knockout primer was designed according to the full -length sequence of sopB gene of Salmonella typhimurium LT2. With pKD4 plasmid as template, the homologous fragments including homologous regions which are similar to sopB gene upstream sequence and downstream sequence respectively and kanamycin cassette with two FRT sites were amplified. Then, the homologous fragments were electrotransformed into the Red -induced S.Typhim
urium LT2 competent cells. Under the pressure of antibiotic and with the work of λ Red system, homologous recombination occurred between the fragments and genome of host strain, and the recombinants were selected on kanamycin agar plate. After the resultant recombinants were verified with PCR, the positive recombinants were cultured at 43℃overnight to eliminate pKD46. To remove the kanamycin resistant relevant DNA fragment, FLP recombinase -encoding plasmid pCP20 was introduced into the recombinants, resulting in a single FRT site within the targeted genomic segment. The markerless mutant strains were detected by genome PCR. The removal of sopB was further verified by the secretion of SopB protein and the induction of pAkt activation in HeLa cells upon S. typhimurium LT2 infection. Considering the results including genome PCR, SopB secretion and pAkt activation in HeLa cells upon infection, it was confirmed that the sopB gene was successfully knocked out
from S. typhimurium LT2 genome with λ Red recombination system. In summary, it is concluded that the sopB gene of S. typhimurium LT2 could be successfully knocked
⽣物技术通报Biotechnology Bulletin2014年第9期172
沙门⽒菌——⼀种⾰兰⽒阴性菌，具有周⾝菌⽑及鞭⽑，能运动，是胞内细菌性病原体，菌型繁多，
迄今为⽌已发现2 000个以上的沙门⽒菌⾎清型。据美国最新数据统计，平均每年沙门⽒菌感染病例约103.4万例，其中需⼊院约19 000例，死亡约1 000例，依然严重威胁着⼈类的健康［1］。
SopB是由沙门⽒菌SPI（Salmonella pathogeni-city island，SPI）-1 T3SS分泌的⼀种由561个氨基酸构成的蛋⽩质分⼦，是⼀种肌醇磷脂酶（Phosphoinositide phosphatase）［2］。在沙门⽒菌感染的过程中，SopB⾸先作⽤于质膜，诱导细胞⾻架重排引起膜的褶皱，促使沙门⽒菌侵⼊宿主细胞［3-5］；⾄感染后期，SopB 主要作⽤于细胞内含沙门⽒菌液泡（应为细胞内含沙门⽒菌膜泡）SCV（Salmonella-containing vacuole，SCV）外膜，通过促进SCV的成熟来保证沙门⽒菌在宿主细胞内的存活和增殖［6］。研究发现，SopB 从宿主细胞的质膜向SCV 外膜的转移与SopB的泛素化修饰直接相关［7］。在此基础上，在⼈肠上⽪细胞中分离纯化到泛素连接酶TRAF6（ TNF receptor associated factor（TRAF）protein 6，TRAF6）是泛素化修饰SopB并介导SopB亚细胞定位的关键酶［8］。此外，更多的研究发现，SopB在沙门⽒菌感染宿主细胞的过程中发挥着复杂多样的⽣物学功能。例如，SopB激活原癌基因Akt473的磷酸化［9］；SopB的过表达能够诱导HeLa细胞⾻架的改变［10，11］；SopB能够激活宿主细胞蛋⽩激酶Erk1/2（The extracellular signal-regulated kinases 1 and 2），p38（P38 mitogen-activated protein kinases）和JNK （c-Jun N-terminal kinases）的磷酸化［12］等。⽽原癌基因Akt473的磷酸化，蛋⽩激酶的激活等功能均被发现与TRAF6的功能有关［13，14］。基于此，为了进⼀步探索TRAF6在沙门⽒菌感染过程中与SopB之间的相互作⽤，本研
究利⽤λ Red 重组系统敲除S. typhimurium LT2 的sopB 基因，构建沙门⽒菌ΔsopB 缺失突变体，并通过检测SopB效应蛋⽩的分泌以及pAkt473的激活对获得的缺失突变体进⾏功能验证。1 材料与⽅法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株、宿主细胞和质粒载体⿏伤寒沙门⽒菌 S. typhimurium LT2 保藏于中国微⽣物菌种保藏管理委员会普通微⽣物中⼼（CGMCC），保藏编号为No.7020。质粒pKD46、pKD4和pCP20由耶鲁⼤学⼤肠杆菌保藏中⼼（E.coli Genetic Resources，li Genetic Stock Center at Yale University）馈赠。HeLa细胞由天津市⾷品⽣物技术重点实验室保存。
1.1.2 主要试剂 Pfu DNA聚合酶、dNTPs、限制性内切酶DpnⅠ购⾃TaKaRa公司；DNA回收试剂盒、DNA Marker均购⾃北京天根⽣物技术有限公司；蛋⽩预染Marker购⾃Fermentas公司；pAkt473以及Akt抗体购⾃Cell Signal Technology公司；SopB 多克隆抗体由本实验室制备（参考发明专利201310029-5060）；偶联HRP⽺抗兔⼆抗购⾃Promega公司；其他⽣物化学试剂均购⾃Amresco公司。
1.2 ⽅法
1.2.1 引物设计根据NCBI数据库公布的S. typhimurium LT2菌株sopB基因序列（GenBank号：AE0064
68.1）设计⼀对敲除引物S1和S2（序列见表1）。其中，S1引物包括59 bp的与sopB基因上游同源的序列H1，S2引物包括59 bp的与sopB基因下游同源的序列H2；同时S1和S2引物还分别包括扩增pKD4质粒卡那霉素抗性基因的上游引物P1（下划线所⽰）和下游引物
P2（下划线所⽰）序列。此外，⽤于PCR验证的sopB基因上游引物（SopB-Former）和下游引物（SopB-Reverse）、P1和P2引物如表1所⽰, 引物位置如图1所⽰。
1.2.2 同源打靶⽚段的获得以质粒pKD4为模板，S1和S2为引物对，进⾏PCR扩增，扩增条件为94℃变性30 s，56℃退⽕30 s，72℃延伸90 s（30 个循环）。经琼脂糖凝胶电泳检测扩增成功后，将扩增成功的PCR产物（同源⽚段）经DpnⅠ在37℃酶切30 min 后，利⽤DNA⽚段回收试剂盒进⾏回收，回收后的DNA⽚段溶于灭菌后的纯⽔中。
out. Moreover, this paper provides a powerful tool for the functional study of SopB effectors during the interaction between Salmonella and host. Also, it supplies the clue for the gene knock-out of other types of bacteria.
Key words: Salmonella typhimurium LT2 λRed recombination system sopB gene Gene knock-out Homologous recombination
2014年第9期173
轴流式压气机
李晔等：利⽤λRed 重组系统敲除⿏伤寒沙门⽒菌sopB基因
1.2.3 Red 重组酶的诱导表达与感受态细胞的制备将2 µL pKD46质粒（约100 ng/µL）⽤氯化钙法转化⾄沙门⽒菌S. typhimurium LT2中，30℃条件下在氨苄青霉素（100 µg/mL）平板上筛选阳性克隆，作为下⼀步转化的宿主菌；将此宿主菌接⼊5 mL 含氨苄青霉素的LB液体培养基中30℃过夜振荡培养，次⽇以1∶100的接种量接种于100 mL 同样的培养基中，30℃振荡培养⾄OD600为0.2-0.3之间后，⽴即加⼊终浓度为5 mmol/L 的L-阿拉伯糖诱导Red 重组蛋⽩的表达；诱导表达1 h 后将培养物置于冰⽔中预冷30 min，4℃条件下8 000 g 离⼼10 min 收集菌体，⽤10％⽢油洗3-4 次，最后将菌体重悬于1 mL 预冷的⽆菌10％⽢油中，取50 µL ⽤于电击转化。
1.2.4 同源打靶⽚段的电击转化取50 µL 含有Red 重组酶的沙门⽒菌感受态细胞与2 µL 同源⽚段加⼊预冷的0.1 cm 电转杯中混匀，设置电压为 2.0 kV（电转化仪型号：ECM 399，BTX公司），进⾏电击转化。电击后迅速加⼊1 mL 预冷的LB液体培养
基，在37℃条件下振荡培养6 h 后，8 000 g 离⼼5 min 收集菌体，最后将菌体⽤100 µL ⽆菌⽔重悬后，涂于含有34 µg/mL 卡那霉素的平板上，30℃倒置过夜培养。
1.2.5 转化⼦的PCR鉴定随机挑取卡那霉素平板上的6个克隆，各接⼊5 mL LB 液体培养基中在37℃条件下过夜振荡培养。次⽇，取2 µL 菌液加⼊PCR⼩管中，再向各PCR管中加⼊48 µL 除模板之外的P
CR 反应体系。利⽤引物P1和SopB-Reverse 引物进⾏菌落PCR扩增。PCR 反应条件同1.2.2，最后⽤琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，并将该产物送⾄英潍捷基（上海）贸易有限公司进⾏测序。
1.2.6 pKD46质粒的驱除⽤⽛签分别蘸取经PCR 鉴定重组成功的菌株，于不含任何抗⽣素的LB平板上划线后置于43℃条件下培养过夜。次⽇⽤⽛签挑取单克隆，先在含氨苄青霉素的平板上划线后，再以同⼀⽛签的同⼀部位于含卡那霉素平板上划线，37℃条件下倒置过夜培养，挑选对氨苄青霉素敏感⽽对卡那霉素具有抗性的克隆。
1.2.7 卡那霉素抗性基因的去除将pCP20质粒⽤电转化法转化到已成功驱除pKD46质粒的重组菌株中，电击结束后取100 µL 菌液涂于含氨苄青霉素的LB平板上，30℃倒置培养过夜，筛选到的Kan s Amp r 菌株就是去除了卡那霉素抗性基因的突变体。再将突变体菌株在42℃培养12 h 以消除温度敏感型质粒pCP20，随后将阳性转化⼦转接到没有任何抗⽣素的LB液体培养基中于37℃条件下培养过夜，取过夜培养菌进⾏PCR验证。
1.2.8 沙门⽒菌效应蛋⽩SopB的分泌检测挑取成功去除卡那霉素抗性基因的菌株接种⾄5 mL LB液体培养基中于37℃条件下培养24 h，8 000 g 离⼼后取上清进⾏Western blot检测。程序包括10％ SDS-PAGE电泳、转膜、SopB多克隆抗体作为⼀抗、偶联HRP⽺抗兔⼆抗进⾏蛋⽩印迹杂交、洗膜、最后进⾏ECL化学发光试剂盒压⽚、洗⽚。同时⽤野⽣型菌株培养液上清作为对照。
1.2.9 沙门⽒菌ΔsopB突变体感染HeLa细胞后对宿主细胞pAkt473激活的影响将培养过夜的野⽣型沙
表1 引物列表
引物名称引物序列（5'-3'）引物长度（bp）S1（H1+P1）ATGCAAATACAGAGCTTCTATCACTCAGCTTCACTAAAAA 79
CCCAGGAGGCTTTTAAAAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
S2（H2+P2）TCAAGATGTGATTAATGAAGAAATGCCTTTTACTGACTGC 79 CAAATATTTTCATCCCCAACATATGAATATCCTCCTTAG
SopB-Former ATGCAAATACAGAGCTTCTATCAC 24
SopB-Reverse TCAAGATGTGATTAATGAAGAAAT 24
P1GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC 20
P2CATATGAATATCCTCCTTAG
20图1 引物位置⽰意图
⽣物技术通报Biotechnology Bulletin2014年第9期174
门⽒菌和ΔsopB突变体离⼼（8 000 g，10 min）后，
先⽤⽆菌⽔润洗⼀遍，再分别⽤适量的DMEM培养
基重悬⾄OD600为0.05，该菌液即为感染液。然后
将两种感染液分别加⼊24孔细胞培养板中，每个细
胞培养孔加0.5 mL，同时以DMEM培养基作为对照。
感染30 min 后吸⾛感染液，加⼊含100 µg/mL 庆⼤
霉素的DMEM培养基以杀死未进⼊细胞的沙门⽒
菌，30 min 后吸⾛培养液并⽤含5 µg/mL 庆⼤霉素
的DMEM培养基继续培养⾄取样时间。收取细胞时，
⾸先利⽤真空泵吸⼲细胞培养液，随后迅速加⼊50
µL 1×SDS 载样缓冲，混匀，沸⽔浴5 min后离⼼即
得到细胞裂解液。将收集的样品按照类似1.2.8的
⽅法利⽤兔源抗pAkt473的⼀抗和⽺抗兔⼆抗进⾏
Western blot杂交。同时⽤Akt抗体作为参照。
2 结果
2.1 靶向敲除sopB基因的长同源臂DNA⽚段的构
建
以pKD4质粒为模板，利⽤S1和S2引物进⾏
PCR扩增，扩增出两翼与sopB基因上下游序列同源，中间为卡那霉素抗性基因的长同源臂DNA⽚段，⽚段长度以及序列组成如图2-A⽰意图所⽰。扩增结果如图2-B所⽰，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后发现，明显扩增出⼀条介于1 000 bp ⾄2 000 bp 之间的，与理论⽚段长度约1 600 bp 接近的DNA条带。
表明成功扩增出两翼与sopB基因上下游序列同源的具有卡那霉素抗性基因的同源⽚段。
2.2 sopB基因的敲除及PCR鉴定
将同源⽚段转化⾄表达Red重组酶的宿主菌后，随机挑取6个在含34 µg/mL的卡那霉素平板上长出的单菌落，进⾏转化⼦的PCR鉴定。由于sopB 编码基因的全序列为1 686 bp，与图2-B中的长同源臂DNA⽚段的长度接近，因此本研究选择特异性存在于长同源臂DNA⽚段上的P1引物和SopB-Reverse引物对重组菌株进⾏PCR鉴定（鉴定引物位置如图3-A所⽰），因为只有成功发⽣同源重组的菌株才能够利⽤P1引物和SopB-Reverse引物扩增出DNA⽚段，DNA⽚段的理论值约为1 567 bp。扩增结果如图3-B所⽰，所选的6个具有卡那霉素抗性的菌株均被成功扩增出了接近1 600 bp的DNA条带，且测序结果也证明序列正确。表明利⽤同源⽚段将沙门⽒菌sopB 基因成功敲除，将该新菌株命名为S. typhimurium LT2 △sopB∷kan
。
M：D2000 DNA Marker；1：同源⽚段的扩增结果
图2 同源⽚段长度以及序列组成⽰意图（A）及同源⽚段扩增结果图（B
）
M：D2000DNA Marker；1-6：挑选出的6个阳性克隆的菌落PCR结果
图3 鉴定引物⽰意图（A）及菌落PCR琼脂糖凝胶电泳结果图（B ）
藤蔓根茎2014年第9期
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李晔等：利⽤λRed 重组系统敲除⿏伤寒沙门⽒菌sopB 基因
2.3 质粒pKD46的驱除
pKD46质粒含有温度敏感型复制起点oriR 101，具有氨苄青霉素抗性。在30℃培养时可以正常复制，⽽在43℃培养时质粒会完全丢失。将结果2.2中鉴定的6个发⽣重组的克隆分别进⾏划线培养。培养结果如图4所⽰，经43℃培养后的6个克隆均能够在含有卡那霉素的LB 平板上⽣长，但是均不能在含氨苄青霉素的LB 平板上⽣长。表明6个阳性克隆中的pKD46质粒均被成功驱除。
沙门⽒菌和两株筛选到的ΔsopB 突变菌株培养24 h 的上清液进⾏Western blot 检测。结果如图6所⽰，在野⽣型沙门⽒菌培养上清中能够检测到分⼦量介于55 kD 和72 kD 之间，⼤⼩约为62 kD 的SopB 效应蛋⽩。与此相反，在构建的ΔsopB 突变菌株上清中则不能检测到任何SopB 蛋⽩的分泌。即与野⽣型沙门⽒菌相⽐，利⽤Red 重组系统构建的ΔsopB 突变菌株失去了分泌SopB 蛋⽩的能⼒，从⽽在蛋⽩质表达⽔平上证实sopB
tomgro基因已被成功敲除。
图4 六个阳性克隆在卡那霉素平板（A ）及氨苄青霉素平
板（B ）上的划线培养结果
2.4 卡那霉素抗性基因的去除与验证
pCP20是⼀种能够编码FRT 位点特异性FLP 重组酶的质粒，FLP 重组酶能够识别卡那霉素抗性基因两侧长度为34 bp 的FRT 位点并通过位点特异性重组将两个FRT 位点中间的序列去除，如图5-A 所⽰，经FLP 重组酶重组后仅在该处留下⼀个单拷贝的FRT 位点。将去除卡那霉素抗性基因后的菌株进⾏PCR 验证，验证引物选择sopB 基因的上游和下游引物，即SopB -Forward 和SopB -Reverse。通过计算，当卡那霉素抗性基因被重组后，从理论上分析能够扩增出约为192 bp 的DNA ⽚段；若卡那霉素抗性基因没有被去除，菌株将被扩增出接近1600 bp 的⽚段。根据图5-B 所⽰的扩增结果，筛选得到的两株菌均得到了分⼦量介于100 bp ⾄250 bp 之间的DNA 扩增带，与卡那霉素抗性基因去除后的理论计算值相符。这表明卡那霉素抗性基因被成功去除，将新菌株命名为S. typhimurium LT2 △sopB 。
2.phimurium LT2 ΔsopB 突变菌株效应蛋⽩
SopB 的分泌检测与验证
在沙门⽒菌培养过程中，部分效应蛋⽩（包括
SopB）能够被分泌到培养液中。基于此，将野⽣型
M ：D2000DNA Marker（⾮蛋⽩，是核酸）；1-2：菌落PCR 结果
图5 抗性基因去除⽰意图（A ）及菌落PCR 琼脂糖凝胶
电泳图检测结果（B
）
WT ：野⽣型沙门⽒菌；1，2：筛选得到的两个ΔsopB 突变体
图6 野⽣型沙门⽒菌及ΔsopB 突变菌株效应蛋⽩SopB 的分泌情况
2.6 sopB 基因缺失对沙门⽒菌感染HeLa 细胞后
pAkt 473激活的影响
将野⽣型沙门⽒菌及ΔsopB 突变菌株分别感染
⽣物技术通报 Biotechnology Bulletin
2014年第9期
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HeLa 细胞后，进⾏Western blot 检测，结果如图7所⽰，随着感染时间的逐渐延长，野⽣型沙门⽒菌感染的HeLa 细胞，其pAKT 473在感染60 min 后被明显激活，但是随后⼜逐渐减弱，⾄感染第120 min
时仅观察到微弱的pAKT 473的激活，这与Knodler 等
［9］
的研究结果相⼀致。与野⽣型菌株完全不同，ΔsopB 突变菌株感染HeLa 细胞后，在检测的所有时间段内，均未检测到pAkt 473的激活。表明本研究中构建的ΔsopB 突变菌株不能够像野⽣型菌株那样在感染HeLa 细胞的过程中激活pAkt 473，进⼀步验证了本⽂中利⽤Red 重组系统构建的突变菌株确为ΔsopB 缺失菌株，即基因敲除成功。
Red 重组系统成功获得了ΔsopB 突变菌株。
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