第42卷
王华南吕辉刘云艳任远
(河南莲花味精股份有限公司项城466200)
摘要：摘要：采用N +离子注入技术对亚适量生产菌株L H 03—186进行诱变处理，经多次离子注 入诱变，筛选乙醛酸和琥珀酰CoA 营养缺陷型菌株，选育出生物素超亚适量突变菌株L H l 2—279，能够在超亚适量工艺条件下保持较稳定的O D ，使谷氨酸发酵产酸和转化率指标分别提高了21．6％和8．5％。
关键词：N +离子注入超亚适量谷氨酸菌种诱变选育
离子束生物技术是新型的通过将低能离子注入生物体内研究生物学效应和作用机理、广泛的应用于遗传育种和基因工程等方面的一种综合技术，离子束诱变育种具有损伤轻、突变率高、突变谱宽、突变性状稳定等突出的优点。
在生物素超亚适量谷氨酸发酵我公司生产使用菌种L H 03-183，但该菌种为生物素亚适量工艺下诱变出的菌种，在引入超亚适量工艺后，已不能达到生物素超亚适量工艺的要求，具体表现在发酵中后期通风比增大后，发酵O D 降幅明显，菌体容易老化，造成发酵产酸偏低。
本文采用低能N +离子注入技术对L H 03—183进行了诱变选育，筛选乙醛酸和琥珀酰C oA 营养缺陷型菌株，得到了适合生物素超亚适量生产工艺的突变菌株L H l 2—279，产酸和转化率较出发菌有明显的提高。
1材料与方法
1．1菌种
莲花味精生物素亚适量谷氨酸发酵生产菌株LH 03—186，黄短杆菌，生物素营养缺陷型菌株，在添加生物素的基本培养基上能够生长，超亚适量工艺发酵生产平均产酸11．59／dL ，转化率 60．2％。
1．2所用设备、仪器及药品、试剂
1．2．1实验所需设备、仪器
■●
离子束注入机、超净工作台、干热灭菌箱、蒸汽灭菌锅、离心机、紫外分光光度计、恒温摇床、分析天平、涡旋混合仪、显微镜、台式水浴恒温振荡器、恒温无菌培养间，三角瓶、容量瓶、培养皿、试管等常用仪器。1．2．2所需药品、试剂
牛物素、乙醛酸、琥珀酰C oA 、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、N aC l 、硫酸铵、琼脂、K H ：P04、
K 2H P04
3H 20、M gS04
7H 200．05、FeS04
7H 20、
M nSO 。H 。0、V B ．等为国产分析纯。1．3培养基：
1．3．1
斜面保藏培养基％
蛋白胨1．0、牛肉膏1．0、N aC l 0．5、琼脂2．0、
pH 7．0～7．2，分装10m l 于试管中，1150C
灭菌20m i n ，静置摆斜面。1．3．2完全培养基C M ％
葡萄糖2．0、牛肉膏1．0、蛋白胨1．O 、酵母膏
0．5、N aC l 0．5、琼脂2．0、pH 7．0～7．2，120c |C 灭菌
20m i n 。1．3．3
基本培养基M M ％
葡萄糖1．0、硫酸铵0．3、K H 2PO 。0．1、K ：H PO 。
3H 200．2、M gS047H 200．05、FeS04
7H 200．002、
M nS 04
H s o 0．002、V 91
2001xg ／L 、生物素50“gC L 、
琼脂2．0、pH 7．0～7．2，120。C 灭菌20r ai n 。(因出发菌株为生物素营养缺陷型，故在基本培养基中补充一定量的生物素)
第!j蓄荤{膂发酵科技通讯
1．3．4筛选培养基SM％
基本培养基+乙醛酸2001山g／L
基本培养基+琥珀酰C oA2001xg／L．
防盗报警装置
1．3．5种子培养基％
葡萄糖4．0、尿素0．5、硫酸镁O．05、玉米浆3．O、K2I t P040．14、硫酸亚铁210。6、硫酸锰210’6、pH7．0～7．2，1150C灭菌20m i n。
1．3．6摇瓶发酵培养基％
葡萄糖20、磷酸氢二钠0．12、硫酸镁0．06、玉米浆0．25、糖蜜0．25、尿素0．6、消泡剂0．1、硫酸亚铁210。6、硫酸锰210。6、生物素210。6、pH7．0～7．2，115℃灭菌20m i n。
1．4培养方法
1．4．1种子培养
从培养24h的斜面菌种上挑取一环菌体接入液体种子培养基，30。C、100r．P．m，培养12h。1．4．2摇瓶发酵培养
种子培养后，l m l接入发酵培养基15m l中300C、100r．P．m，培养34h。
1．5诱变方法
选N+注入诱变处理，出发菌株的浓度108／m l 左右，细胞处于对数生长期。步骤如下：
业务激活
1．5．1制备菌悬液
1．5．2吸取制备好的菌悬液0．1m l均匀涂布于灭过菌的直径9em的培养皿中，在超净工作台上吹干，
用于做存活率统计的诱变处理将菌悬液均匀涂布于1em×l em的无菌盖玻片上。
1．5．3放入离子注入机靶室进行离子注入，对照也一同放入，只抽真空不进行离子注入。N+注入能量选择30keV，五个不同剂量为3×1014N+／cm2、5×1014N+／em2、l×1015N+]cm2、5×1015N+／cm2、1×1016N+／cm2。
1．5．4使菌体融人无菌蒸馏水，取1m l梯度稀释取合适浓度涂完全培养基，进行菌落统计计算不同剂量N+注入存活曲线，确定诱变剂量进行诱变和筛选工作。
1．6筛选方法
1．6．1营养缺陷性菌株筛选
目标菌株为乙醛酸和琥珀酰C oA营养缺陷型即只能在筛选培养基卜-(即加有乙醛酸和琥珀酰C oA的基本培养基上)生长，在基本培养基上无法生产，故先把已诱变的菌液涂布于乙醛酸筛选培养基上培养3d，再用影印法把所有菌落接种到琥珀酰C oA筛选培养基和基本培养基上(即用一小块灭菌的丝绒固定于直径比培养皿小的圆柱形木块上，构成印章式的接种工具，然后把长有菌落的筛选培养皿倒置在丝绒印章上，轻轻印一下；再把此印章在琥珀酰C oA筛选培养基和基本培养基平板上轻轻印一下)，培养3d，挑选在乙醛酸筛选培养基和琥珀酰C oA筛选培养基上均能生长的菌落但在基本培养基上无法
生长的菌株即乙醛酸和琥珀酰C oA双重营养缺陷型菌株。将营养缺陷型菌落用接种环挑取至斜面培养基上扩大培养。
1．6．2摇瓶发酵筛选
刮取斜面培养基上的菌落1环至一级种子培养基中(250m l三角瓶装入种子培养基80m1)，在32℃，转速100r．P．m条件下摇床培养12h左右，以种子O D净增0．5以上为准，把种子按10％接种量接人发酵培养基摇瓶(500m l装入发酵培养基150m1)，温度控制0～8h34qC、8～14h35℃、14-20h 36℃、20～26h37℃、26—34h38℃；转速0～8h 100r．P．I Tl、8-26h200r．P．i n、26-34h150r．P．m；每4小时流加尿素，培养34小时测定O D、残糖、谷氨酸，并做原始菌种对照，筛选产酸高的菌株。
1．7测定方法
糖含量的测定：快速检测用糖酸双功能仪测定，精确测定用费林法滴定。
G A的测定：快速检测用糖酸双功能仪测定，精确测定采用华勃氏微量呼吸机测定。
生物素的测定：采用超高效液相谱一质谱联用测定。
2结果与讨论
2．1离子注入诱变效应
2．1．1存活率曲线的制作与分析
为了得到适宜的离子注入剂量，以仅进行真空处理而不进行离子辐射的菌样作对照，以不同
离子辐射存活曲线
120
l O O
80
60
导联线40
20
O
0O．5l25l O
剂量×l d5N+／cm 2
油动多旋翼发酵科技通讯第42卷
2．1．2最佳注入剂量的选择
随机从各个剂量辐射后所涂平板中挑取50个单菌落，经摇瓶发酵培养后，测定谷氨酸含量。以出发菌株的产酸量作对照，产酸量提高5％的菌株为正突变株，下降5％的菌株为负突变株。
L H03-186菌株辐射后突变率
剂量x15N+／cm200．512510
由上表可知当离子注入的剂量为1×10”N十／cm2时可得到较高的正突变率，参考2．1．1离子辐射存活曲线可知该注入剂量下菌体的致死率为74％，证明了微生物在进行诱变处理时致死率为70％一75％其正突变率较高。根据试验结果，选择1x1015N+／c m2的剂量对出发菌株L H03—186进行诱变处理。
2．2L H l2—279菌株的诱变选育
以LH03—186为出发菌株，离子注入剂量1X 1015N+／cm2诱变，通过一次和二次注入，乙醛酸和琥珀酰C oA营养缺陷型初筛、摇瓶复筛出最高一株产酸、转化率较出发菌株高21．6％和8．5％生物素超亚适量谷氨酸生产菌种LH l2—279。
2．3菌株的遗传稳定性
卷纸筒将L H l2—279菌株斜面划线培养，传代5次。每代涂平板分离单菌落，各挑取20个单菌落作发
常
尝
尝
尝
鬻
鬻
酵试验。与亲株相比产酸量改变在5％以内的计做稳定株。测定谷氨酸产量及稳定率，以及对乙醛酸
、琥珀酰C oA营养缺陷型的鉴定，结果见下表。由表可见，该突变株的遗传稳定性较好，连续传种5次，其产酸未见明显变化，营养缺陷型标记遗传较好。
定压功放电路图菌株LH l2-279的遗传稳定性
传代数F1F2F3F4F5谷氨酸产量g／dL14．114．014．114．013．9转化率％63．463．363．163．363．O 乙醛酸营养缺陷型士++++【琥珀酰CoA营养缺陷型+++++
+表示营养缺陷株
3结论
诱变突变株L H l2—279在超亚适量发酵车间进行生产应用，产酸和转化率稳定，中后期O D比较稳定，说明L H l2—279适应谷氨酸超亚适量工艺，能够给企业带来良好的收益。
参考文献：
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[5]施巧琴、吴松刚主编．T业微生物育种学(第二版)科学出版社2003
业业业业业业业业盘业业业蛊业业业业业出业业业业业业业业业业业业坐船妇业船业盥业业啦业谷氨酸提取过程中产生泡沫多的原因有哪些?
提取过程出现泡沫多的原因有：
1糖液质量差，带人蛋白质、糊精等物质；
2发酵感染噬菌体、杂菌和同料罐带人大量菌体蛋白质；
3放罐时罐压升得过高，放罐速度太快，产生大量泡沫，或停罐搅拌放罐使泡沫集中在上部；
4各生产菌差异，提取过程产生泡沫也不一；
5培养基配方不同，泡沫也不同。
——《味精生产问答》题226——
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