一、实验目的
1.学习掌握从植物中提取DNA的方法；
2.学习掌握从CTAB法提取植物DNA原理、方法及过程。
二、实验原理（CTAB）
大豆DNA提取的方法很多，如提取质量高，得率较低的CTAB(溴化十六烷三甲基铵)法；提取得率高，质量较好的SDS(十二烷基磺酸钠)法；用于少量提取的SarcosylCTAB，SDS，Sarcosyl都是洗涤剂性质的化学药品，主要的破膜成份，可将细胞内的物质释放出来。
大豆DNA提取所用的材料可以是种子、幼苗或叶片、根系、茎等各部分组织。在分子生物学上常用的材料是叶片，转基因检测或进口大豆检测时常用到子粒。利用叶片作为提取材料时，若在田间种植材料，并做其它特性鉴定的情况下，多是在长出3～5片三片复叶时，取上部嫩叶，选用较嫩的叶片材料才可能显著提高提取的DNA浓度。但要保留生长点；若种植材 料只是为取叶片提取DNA时，可在室内用营养钵种植，长出足够嫩叶即可取叶片。抽提DNA中主要杂质为碳水化合物，同时为了减少叶绿素对提取DNA纯度和颜的影响，在采样前将取样植株在暗室放置2～3d，可以大大降低叶片中可溶性碳水化合物的含量，伯胺
从而提高提取DNA的纯度。根据所用材料的不同而采取不同的提取方法，通常对于叶片DNA的提取采用SDS法，而大豆子粒或大豆粉采用CTAB法效果较好。 大豆DNA提取无论采取传统的CTAB法、SDS法还是采用现在所改良的一些方法，其步骤有繁有简，但归纳起来都要进行以下5个方面工作：破壁、破膜、抽提、沉淀和溶解。各提取方法有一些差异，但原理一致。 1.破壁(破坏细胞壁)
植物DNA提取与动物不同，植物细胞与组织具有较硬的细胞壁，大量酚类、素、多糖、单宁等物质，给DNA的提取与纯化带来许多困难。所以提取时必须先破坏细胞壁。用叶片作为材料破壁的方法最常用的是液氮研磨法，尽量取鲜嫩叶片，放入研钵，加入液氮研磨，一般要加入3～4次液氮。研磨好的特征是叶片粉末颜由绿变白。如果研磨样品量非常少(如转基因植株检测)，可将叶片放入1.50mL的Eppendorf离心管，将离心管放入液氮
中，用塑料杆头的电钻研磨，效果较好。一些实验室有使用玻璃匀浆器的，但效果不是很好。
2.破膜(破坏细胞膜，释放细胞内物质)
破膜的主要成份是去污剂，如上面所列举的CTAB、SDS、Sarcosyl等。还有Tris·Cl、EDTA、NaCl等成份。Tris·Cl是缓冲液，提供一个pH值稳定的环境；EDTA可以螯合金属离子，而某些金属离子对酶类的活性是至关重要的，如Mg2+。如果酶不能与金属离子结合，酶就失去了活性，核酸酶类也是如此，所以EDTA可避免提取DNA时核酸酶类污染，造成DNA的降解；NaCl可以提供一个高盐的环境，为进一步去除蛋白质所必需的。而1mol·L-1的NaCl浓度是大豆新鲜叶片快速分离DNA的理想条件。DNA提取液要特别注意pH值，因为在偏酸的条件下，RNA稳定，而DNA不稳定，在偏碱的条件下，DNA稳定，而RNA不稳定，因而DNA提取液pH值应在8.0左右，pH值的调节应重点放在EDTA溶液的配制上。 3.抽提(去掉蛋白质及其它杂质)
抽提的主要目的是去除蛋白质。去除蛋白质的试剂主要是苯酚和氯仿。苯酚应使用pH值为
8.0的Tris饱和酚，碱性环境可以保证DNA不被降解，因而不能使用pH值为5.0的水饱和酚。苯酚去除蛋白质的效果比较好，但苯酚与水相溶，二者不分层，不能很好地去除苯酚，而苯酚长时间存在会导致DNA降解。为了避免这种情况发生，常常用酚仿试剂，即苯酚∶氯仿∶异戊醇为25：24∶1的混合液。氯仿也有抽提蛋白质的作用，但效果不是太好。苯酚在氯仿中的溶解度比在水中的溶解度高，因而苯酚更易溶于氯仿中。氯仿与水不溶，二者分为两相，即会出现分层现象。通过离心，可以使分层更为彻底，从而除掉苯酚及氯仿。异戊醇主要是减少抽提过程中翻转产生的泡沫，达到较好的抽提效果。也有人采用氯仿— 异戊醇代替酚抽提，由于氯仿— 异戊醇易溶于异丙醇，并易于挥发，由此克服了由于酚等的残留带来的DNA降解及酶切上的困难。
4.沉淀(沉淀DNA)
沉淀常用试剂为异丙醇和乙醇。大量DNA提取时，一般用预冷(-20℃)的异丙醇进行沉淀，即根据DNA抽提后得到上清液的体积加入等体积预冷助勃器的异丙醇。有人在抽提前和抽提后分别用异丙醇进行沉淀，DNA得率提高。这是因为用异丙醇反复沉淀，有利于特异性地沉淀核酸，提高核酸的产量。总的来讲，用异丙醇沉淀DNA的效果较好，但也有一个突出的缺
点，就是异丙醇不容易挥发出去，这对后期DNA溶解有不良影响。无水乙醇的沉淀效果没有异丙醇好，沉淀时往往加入量大，即根据DNA抽提后得到上清液体积加入二倍体积的无水乙醇。无水乙醇的优点是易挥发，容易去除。为了解决这些矛盾，实验中常常先用异丙醇沉淀DNA，再用70%酒精清洗，这样70%洒精就可将异丙醇溶解出来，而酒精又可挥发出去。因此在精提DNA时，常只用无水乙醇沉淀，而不用异丙醇。沉淀要注意的另外一个问题是，当将抽提后的上清液加入异丙醇或乙醇时，不应太急，要缓缓地旋转地加入，而且沉淀时要避免上下颠倒，以免导致DNA降解。
5.溶解(溶解DNA)
溶解DNA一般采用两种方法。一种方法是用超纯水溶解，另一种是用TE缓冲溶液溶解。用超纯水溶解不利于DNA的长期保存，因为在水中DNA双链不很稳定，易降解。其优点是可以直接用于各种生物技术操作。TE缓冲溶液中含有Tris·Cl和EDTA，可以维持DNA双链的稳定性。EDTA是金属离子的螯合剂，可防止各种核酸酶的酶解，但也会抑制实验中各种酶的活性，影响实验结果，所以TE缓冲溶液溶解的DNA在使用时需要沉淀，用超纯水重新溶解。因此，DNA长期保存时，应用TE缓冲溶液溶解；而DNA提取后立即用于实验时，则应用固体破碎机超纯水溶解。
小结
对于DNA的提取，进行各种试剂和方法的研究，在不同实验条件和不同操作人员效果不同。如能遵循上述基本原理，大豆DNA的提取将得到较好结果。在DNA提取时，不能简单地按照操作步骤中的时间或离心的转速，应注意各个步骤中的典型特征是最重要的。如破壁时叶片的由绿变白，抽提时的蛋白质沉淀析出等。只有掌握这些特征，实验才能做到有的放矢，及时调整实验中的不定因素，得到好的混纺纱结果。
二、药品耗材
100 mL 1M的Tris-HCl (pH=8.0)的配制：称取12.114g Tris碱固体溶于80 mL ddH2O中，加4.2mL的质量分数为37%浓盐酸，调节酸碱度到pH值为8.0后，溶液定容至100 mL。
200mL的质量分数为2%的CTAB提取液的配制：4g的CTAB固体，16.364g氯化钠（NaCl），1.48g固体EDTA•Na•2H2O，20mL的1M Tris-HCl（pH=8.0），用ddH2O定容至200mL，121℃下灭菌20分钟。使用时每40mLCTAB提取液加10μL巯基乙醇。
氯仿、异丙醇、异丙醇、酒精、液氮、ddH2O、移液头、离心管。
三、仪器设备
离心机、涡旋仪、移液、水浴锅、离心管架。
四、方法步骤
（1）CTAB在65℃水浴中预热，取大豆叶片在液氮中研磨成粉末状。
（2）取200mg样品（约在离心管0.1刻度线以下）放入1.5mL离心管中，加入600μL CTAB，颠倒混匀5-6次，65℃水浴15分钟。
（3）再加等体积的氯仿异戊醇(24:1)溶液轻轻摇晃30秒，在4℃下12000rpm/分钟离心1分钟后，吸取上清液放置于干净的离心管中。
（4）加入同体积的预冷异丙醇溶液，充分颠倒混匀，用移液反复吹吸几次并重复一次，这时可见分散的絮状物，在4℃下12000rpm/分钟离心2分钟后，弃上清液，保留下面沉淀。
（sim卡托5）用600μL70%乙醇洗涤沉淀，用移液反复吹吸几次并重复一次，弃除乙醇（也可以
低速离心1-2分钟），在室温下将离心管倒置于吸水纸上晾干。
（6）沉淀用TE溶液溶解DNA，再加入RNase至终浓度50μg/mL，在37℃下保温半小时，将DNA样品放入冰箱长期保存。短期保存可直接用超纯水溶解放在-20℃下保存。
五、实验注意事项
（1）DNA二级结构易“变性”。DNA的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件。
（2）抑制内外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：a、低温操作；b、调节pH，使偏碱（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性剂；d、加螯合剂（EDTA）除去酶的铺助因子（Mg2+），使酶活性丧失。
（3）防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素，会使DNA降解，一般综合考虑，取pH8.0左右为宜。
（4）防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等，DNA分子特别大，其分子量可达1012道尔顿，极易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂，所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。
（5）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或素类化合物）对核酸提取有干扰作用。因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少，DNA含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的。
分离提取植物DNA的方法很多，本实验采用CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法和电泳鉴定。
六、思考题
1.CTAB悬挂链方法原理是什么？
答：植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染质或染体）的形式存在于细胞核内。CTAB是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能
与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀。
2.异丙醇沉淀DNA是什么作用。
答：异丙醇可以将DNA从溶液中溶液沉淀出来，减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡，降低表面张力，从而减少气泡产生。另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
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