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牧草收割机环介导等温扩增快速检测病原菌新型试剂盒研制
可行性研究报告
rna测序
李思光
切口铣刀南昌大学
一、选题的必要性
本项目属生物高技术领域，是国家重点支持的研究领域，项目主要针对严重影响人类健康的主要病原菌的检测与诊断需要进行检测技术的研究与试剂盒的开发，本项目的实施可产生具有自主知识产权的科研成果。本项目技术含量高，市场竞争力强，项目完成后能够产生较好的经济效益和社会效益，项目符合国家产业、技术政策。
2、项目所处技术领域技术发展现状
目前的病原菌检测方法费时、费力、准确性低，开发快速、准确、低成本的检测技术和配套试剂是病原菌检测工作中亟待攻克的难题。本项目针对病原菌检测中存在的问题，采用高灵敏度、高特异性的环介导等温扩增技术开发出简便、快速、经
济的检测试剂。
3、项目技术先进性，对相关领域技术进步的推动作用
环介导等温扩增是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA 的新技术。该技术在1h内能扩增出109靶序列拷贝。LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。该技术的推广对生物学、食品科学及医学领域中的检测和诊断技术的进步有推动作用。
4、项目目前进展情况
课题组开展了大量前期研究工作，已完成了本项目所需的科研平台建设任务，开展了嗜水单胞菌和金黄葡萄球菌的环介导等温扩增研究，取得了阶段性研究成果，这些工作为本
项目的顺利完成奠定了基础。
二、技术方案论述
（一）项目技术关键点和创新点，项目完成时达到的技术水平
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1、技术关键
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（1）本项目的技术关键之一是引物设计。与常规PCR引物不同，环介导等温扩增引物设计难度大，一组引物要求有6个位点与靶序列完全匹配才能够进行扩增。目前我们已从国际基因组数据库中下载了部分病原菌的基因组DNA，并根据基因组特点采用等温扩增软件设计了部分引物，现正通过实验确定这些引物的性能。
（2）本项目的另一技术关键是最佳等温扩增体系优化。通过对引物浓度、内引物和外引物的最佳浓度比、模板浓度、dNTP 浓度、BstDNA聚合酶用量、Mg2+浓度等条件进行优化，能够获得最佳实验条件。
2、创新点
（1）既往对病原菌的检测一般采用细菌分离培养鉴定法，但该方法的准确率低，所需时间长，往往延误临床正确的诊断和。近年来，人们将PCR技术用于病原菌的检测。PCR技术虽然较传统方法灵敏、快速，但需要较昂贵的仪器设备。更为重要的是，PCR方法容易产生非特异性扩增产物，造成假阳性和假阴性结果，影响对样品的正确判断。本项目将建立适合于食品和临床标本大规模检测的环介导等温扩增快速检测病原菌技术。与目前的检测方法相比，等温扩增法具有快速、准确、灵
敏的特点。而且，等温扩增法是在恒温下进行，只需一个简单的恒温装置，不需要PCR实验中的昂贵仪器，因而易于在基层食品质量检测部门和医院推广使用。
（2）目前，国外已有将环介导等温扩增技术应用于病毒DNA和RNA检测的报道，但将其应用于病原菌检测的文献报道极少，国内基本上还未开展环介导的等温扩增研究工作。本项目首次提出将环介导的等温扩增技术应用于食品和临床标本中病原菌的检测，并对目前的等温扩增方法提出改进策略，发展可同时检测多种病原菌的多重等温扩增技术，以克服当前一个等温扩增反应只能检测一种DNA或RNA的缺点。因此，本项目的实施，将开发出具有自主知识产权的病原菌检测试剂盒。
3、项目完成时达到的技术水平
项目完成时，开发的多重环介导等温扩增快速检测病原菌技术及其配套试剂盒达到国际先进水平。
（二）项目技术方案
1、技术方案
（1）环介导等温扩增（LAMP）和多重等温扩增快速检测常见病原菌方法的建立
①常见病原菌特异性LAMP引物的设计。根据GenBank数据
库公布的常见病原菌DNA序列，采用LAMP专用引物设计软件设计特异性LAMP引物（包括每类致病菌的两个外引物、两个内引物和两个环引物，其中每个内引物均具有两段能够识别靶分子上特定位点的序列，以保证靶序列的特异性扩增。）
②常见病原菌基因组DNA的提取。采用本实验室建立的基因组DNA快速提取技术提取致病菌DNA。
③LAMP扩增反应体系的优化：对引物浓度、内引物和外引物的最佳浓度比、模板浓度、dNTP浓度、BstDNA聚合酶用量、Mg2+浓度等条件进行优化。
④温育条件的优化：在55-65℃之间优化等温扩增温度。
⑤扩增产物的检测：建立快速显法和电泳分析法两种检测扩增产物的方法。
⑥以上述研究结果为基础，建立常见病原菌的环介导等温扩增和多重环介导等温扩增快速检测技术。
（2）常见病原菌的环介导等温扩增快速检测方法的灵敏度分析
将常见病原菌目标基因克隆至pMD-18T载体，转化后提取质粒，倍比稀释成含目的基因拷贝数为105、104、103、102、101，以其为模板做环介导等温扩增反应，检测本方法的灵敏度。
（3）常见病原菌的环介导等温扩增快速检测方法的特异性分析
分别以病原菌和非病原菌基因组DNA为模板做环介导等温扩增反应，检测本方法的特异性。
（4）常见病原菌的环介导等温扩增快速检测方法与国际标准方法及常规PCR扩增方法比较分析
以LAMP的两个外引物做常规PCR扩增，并与LAMP的扩增结果进行比较分析，进一步判断LAMP技术的灵敏度、特异性和稳定性。
（5）常见病原菌的环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测方法在食品检测和临床诊断中的应用研究
将本方法应用于食品检测和临床诊断中，分析本方法对不同样品检测的准确率。
（6）病原菌的环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测试剂盒的研制
根据本项目所建立的LAMP最佳反应体系和LAMP反应产物显示方法，研制开发快速检测病原菌的试剂盒（包括单一病原菌检测试剂盒和多种病原菌同时检测试剂盒）。
2、工艺流程
（三）项目技术质量指标
（1）本项目建立的方法对病原菌检测的准确率达到95%。
（2）本项目建立的方法对病原菌目的基因检测的灵敏度达到101拷贝。
（3）本项目建立的方法不产生非特异性扩增产物。
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