【ERA技术】
通过模拟⽣物体遗传物质⾃⾝扩增复制的原理，将来源于细菌，病毒和噬菌体的特定重组酶、外切酶、聚合酶等多酶体系进⾏改造突变并筛选其功能，通过不同的核酸扩增反应体系进⾏优化组合，从⽽获得核⼼的重组等温扩增体系，在37-42℃恒温条件下，可将微量DNA/RNA的特异性区段在数分钟内扩增数⼗亿倍，即（酶促恒温扩增技术）ERA技术⽅法。 1、ERA扩增试剂盒应在怎样的温度下使⽤？
标准的ERA扩增试剂盒经过配制可在37℃-42℃的温度范围内操作。过⾼的温度会对反应体系产⽣不利的影响，因为酶会逐渐地失去全部活性。对于RT试剂盒，我们建议客户在40℃下运⾏反应，因为逆转录酶在稍⾼温度下具有更⾼的活性。
经过⼀种ERA扩增试剂盒测试过的引物，能直接⽤于其他ERA扩增试剂盒吗？ 2、经过⼀种ERA扩增试剂盒测试过的引物，能直接⽤于其他ERA扩增试剂盒吗？
不⼀定。如果您已设计筛选出ERA基础型核酸扩增试剂盒的引物，⽤于ERA荧光型或ERA试纸型核酸扩 增试剂盒时还需要引⼊探针。这个意味着跑胶检测、荧光检测或是测流层析检测对引物的最佳组合可能有着不同的要求。通常情况下，使⽤相同的引物探针从ERA荧光型转为ERA试纸型能获得相当可靠的结果，此时ERA试纸型荧光信号强度会⼤幅度减弱，但不会影响灵敏度检测。荧光检测的最佳引物/探针组合不⼀定是跑胶检测的最佳引物组合，反之亦然。从DNA检测分析转为RNA检测的逆转录分析情况更复杂，因为逆转录酶对引物有着不同的偏好。就这⼀点⽽论，我们建议使⽤RT试剂盒在RNA模板上设计RNA检测，⽽不是使⽤DNA试剂盒优化后的结果尝试转为使⽤RT试剂盒。 当我向扩增试剂中加⼊事先配制好的预混液时，扩增试剂变浑浊，这有问题吗？
塑料槽板3、当我向扩增试剂中加⼊事先配制好的预混液时，扩增试剂变浑浊，这有问题吗？
这对于ERA反应来说属于正常现象，没有问题。ERA反应会形成乳状液，有时⾁眼可观察到此变化。
可以保存ERA扩增反应产物吗？
4、可以保存ERA扩增反应产物吗？
可以，基础型、RT-基础型、试纸型或是RT-试纸型反应体系的扩增产物短期可以保存在4℃下，长期保存建议-20℃。但荧光型（RT）扩增产物不能保存。如果在反应结束后未经迅速失活处理，核酸酶会逐渐消化扩增产物。
可以对EAR扩增反应进⾏终点分析吗？
5、可以对EAR扩增反应进⾏终点分析吗？
可以，但不包括荧光型（RT）试剂盒。因为在反应结束后，未经迅速失活处理，核酸酶会逐渐消化扩增产物。要分析扩增产物，请使⽤基础型（RT）或试纸型试剂盒进⾏跑胶检测分析。
可以将激活剂添加⾄重悬试剂中吗？
6、可以将激活剂添加⾄重悬试剂中吗？
如果您在使⽤基础型（RT）、试纸型（RT）反应体系时，是可以添加的。
硅胶模具制作方法不过⼀旦加⼊激活剂，反应体系⽴即被启动。在最后添加激活剂时，我们建议将激活剂添加到8联排反应管的盖⼦上，并将其离⼼⾄反应体系中，这样便可确保反应同时开始。
如果您在使⽤荧光型（RT）反应体系时，是不可以添加的。当体系⾥⾯有激活剂存在时，引物和探针会受到核酸酶的破坏，便会导致反应中出现很⾼的荧光基线。
可以在反应体系中加⼊更多/更少的溶解剂吗？
7、可以在反应体系中加⼊更多/更少的溶解剂吗？
不可以。加⼊⽐建议更多或更少的溶解剂会对ERA反应的进⾏⽅式产⽣不利的影响。溶解剂中包含ERA反应所需的成分，因此加⼊更多或更少的溶解剂将会改变其在重悬试剂中的最终浓度。
可以制备预混液吗？
8、可以制备预混液吗？
可以。如果您想建⽴多个反应，可以制备预混液。在筛选不同的DNA时，可以将溶解剂、引物和探针（如果使⽤）混合在⼀起，并加到扩增试剂中重悬。然后将不同的DNA加⼊反应体系，最后照常激活剂启动反应。在筛选不同引物时，可以将溶解剂、模板DNA、探针（如果使⽤）和⼀个引物制成预混液，并将其分装到1.5ml⼩管后再分别加⼊不同的引物。只有当两个引物都存在时，才能重悬扩增试剂，否则会使重组复合物的形成偏向先添加的引物。
9、跑胶之前需要纯化EAR扩增产物吗？
跑胶之前需要纯化EAR扩增产物吗？
需要。ERA反应体系⾥的所含试剂和蛋⽩会⼲扰正常的琼脂糖凝胶电泳，如果不进⾏产物纯化，跑出来的可能是弥散条带⽽不是⼲净的条带。
如果要运⾏ERA反应，需要哪种类型的仪器设备？
10、如果要运⾏ERA反应，需要哪种类型的仪器设备？
本公司有⼀款⾃主开发的GS8恒温荧光检测仪，简单便携。基础型（RT）和试纸型（RT）适⽤于任何能保持37-42℃的稳定温度的设备。对于使⽤荧光型（RT）试剂盒进⾏实时反应时，可使⽤能激发并检测所⽤荧光基团（最佳激发波长为492nM，最⼤发射波长为520nM）并能保持37-42℃稳定温度的仪器设备或实时热循环仪，注意，在运⾏ERA反应时，盖加热功能应关闭。这⾥推荐使⽤本公司⾃主开发的GS8恒温荧光检测仪，简单便携。也可使⽤ABI 7500，LightCycler480，CFX 96等荧光定量PCR仪。
11、使⽤ERA扩增试剂时，我可以如何提⾼⼀致性和改善RNA靶基因的扩增？
如果模板RNA在添加到反应之前先与激活剂合并，这可能使RNA的三级结构稳定化，从⽽导致逆转录酶受到抑制。现将模板RNA添加到反应混合液中再添加激活剂，或相隔⼀段距离（即RNA与激活剂分别添加到反应盖⼦的相对两侧）同时添加，这样可提⾼性能。
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12、出现假阳性的结果，可能的原因有哪些？
12、出现假阳性的结果，可能的原因有哪些
如果在⽆模板对照中观察到假阳性结果，则通常是由污染引起的。我们建议区分试剂配制区和扩增分析区。在使⽤任何扩增后打开反应管的终点检测⽅法时，必须采⽤严格的污染控制措施。要排除或清除污染，我们建议⽤消毒液或 75%的酒精对⼯作区域进⾏消毒，并使⽤新的扩增试剂（溶解剂、激活剂等）。可能需要重复⼏次清洁，才能彻底清除污染。
在荧光型（RT）反应即将结束时，有时会看到荧光急剧增强，这正常吗？
13、在荧光型（RT）反应即将结束时，有时会看到荧光急剧增强，这正常吗？
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正常。在荧光（RT）反应中，聚合酶和核酸酶处于竞争关系。随着反应的能量逐渐耗尽，结果导致探针更快地裂解和荧光信号出现剧增。
在⽤测流层析试纸进⾏检测之前需要稀释ERA扩增产物吗？
14、在⽤测流层析试纸进⾏检测之前需要稀释ERA扩增产物吗？
需要。ERA反应体系⾥的试剂和蛋⽩会⼲扰测流层析试纸上的抗体，如果不进⾏充分稀释就会出现⾮特异性结合和假阳性信号。
试剂盒在运输时处于室温，它还能使⽤吗？
15、试剂盒在运输时处于室温，它还能使⽤吗？
可以，试剂盒处于室温下3天不会有问题，仍然可以使⽤。对于长期储存，我们建议储存在-20℃。
ERA引物需要多长？
16、ERA引物需要多长？
衣物加香为了充分利⽤ERA的检测速度和灵敏度，我们建议客户使⽤29-32个核苷酸长度的引物。通常情况下，PCR引物可⽤于ERA反应体系，但这类引物的检测速度和灵敏度可能不及较长的引物。
ERA引物应当相距多远？
17、ERA引物应当相距多远？
⼀般⽽⾔，我们建议两个ERA引物产⽣的扩增⽚段不应超过300bp。ERA扩增⽚段的⼤⼩或许没有下
限，不过根据ERA引物最⼩长度，扩增⽚段的⼤⼩最⼩约80bp。为了获得最快的检测速度，最终的扩增⽚段长度应为100-200bp。
我需要筛选多少引物？
18、我需要筛选多少引物？
这取决于您对检测灵敏度的要求。举例来说，如果您只需要每个反应检测1000个分⼦或以上，那么⼤多数引物对都够⽤了。对于极⾼灵敏度的检测，最好是进⾏系统性的引物筛选以到好的ERA引物。最初筛选时，测试的引物条数通常是正反向引物各7条。测试的引物越多，到能够检测单个分⼦的好引物对的⼏率就越⼤。
我该如何选择探针？
19、我该如何选择探针？
如果使⽤适⽤于探针的其中⼀种试剂盒，需要注意的是，在标靶区域选择探针位置时，有⼀些序列限制。如果存在不合理的限制，本公司可帮助您设计备选检测⽅案。
我如何配制冻⼲引物、探针？
20、我如何配制冻⼲引物、探针？
药盒通常，⽤ TE（10mM Tris-Hcl pH8.0 0.1mM EDTA）来制备 100μM 的储存溶液， 并长期储存于-20℃。
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荧光强度检测重复性的变异系数和荧光强度检测精密度的变异系数还有反应灵敏度能查到吗？
21、GS8的
GS8的荧光强度检测重复性的变异系数和荧光强度检测精密度的变异系数还有反应灵敏度能查到吗我们出⼚有⼀定测试设定，重复性cv<=5%。md2.pub
荧光精密度主要是⼀个变化参数，⼀般pcr仪器都是测试的荧光变化值。我们根据试剂反应功能测试。
灵敏度也是参考试剂⽽定，⼀般仪器和灵敏度⽆关。
侧向流检测试纸条（卡）常见问题解析
22、侧向流检测试纸条（卡）常见问题解析
先达基因（gendx）ERA产品系列
品名 规格
金属卤化物灯镇流器基础型核酸扩增试剂盒（ERA法） 24/96T/盒
RT-基础型核酸扩增试剂盒（ERA法) 24/96T/盒
荧光型核酸扩增试剂盒（ERA法） 24/96T/盒
RT-荧光型核酸扩增试剂盒（ERA法） 24/96T/盒
试纸型核酸扩增试剂盒（ERA法） 24/96T/盒
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