ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－７３８６．２０２１．０５．０１１
·论著·
邸红芹 安晓颖 张辉 高艳君 陈宁 刘战地
项目来源：河北省科学技术研究与发展计划项目（编号：１７２７７７９７Ｄ）
作者单位：０５００４１ 石家庄市，河北省胸科医院
通讯作者：刘战地，０５００４１ 石家庄市，河北省胸科医院；
Ｅ ｍａｉｌ：１５６３３０３７１２０＠１６３．ｃｏｍ
【摘要】 目的 评估多重荧光定量ＰＣＲ法在呼吸道病原体（包括铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、金黄葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌、流感嗜血杆菌）检测中的价值。方法 以恒温芯片法为参照检测方法，通过检测呼吸 自锁角度道病原体标准菌株以及临床样本，比较多重荧光定量Ｐ
变速盘
ＣＲ法和恒温芯片法的检出率。结果 与恒温芯片法相比多重荧光定量ＰＣＲ法具有很高的特异性与一致性且呼吸道病原体的检出率差异无统计学意义（χ２
＝０．４１０，Ｐ＝０．５２２）。同时对单一病原体的检出率显示，两种检测方法的检出率差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），一致性分析（Ｋａｐｐａ值）显示两种检测方法具有高度一致性（Ｋａｐｐａ＞０．７５）。结论 多重荧光定量ＰＣＲ法与恒温芯片法相比具有高度一致性，在呼吸道病原体检测中具有良好的应用价值。
【关键词】 呼吸道感染；病原体；多重荧光定量ＰＣＲ法；恒温芯片法【中图分类号】 Ｒ４４６．１１２ 【文献标识码】 Ａ 【文章编号】 １００２－７３８６（２０２１）０５－０６９３－０４Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｙｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰＣＲａｎｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｈｉｐｍｅｔｈｏｄｉｎｄｅｔｅｃｔｉｎｇｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｐａｔｈｏｇｅｎｓ ＤＩＨｏｎｇｑｉｎ，ＡＮＸｉａｏｙｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＨｕｉ，ｅｔａｌ．ＨｅｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃａｉｌＣｈｅｓｔＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｈｅｂｅｉ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００４１，Ｃｈｉｎａ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰＣＲｉｎｄｅｔｅｃｔｉｎｇｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ
ｐａｔｈｏｇｅｎｓ
，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓａｎｄＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔａｋｉｎｇｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｈｉｐｍｅｔｈｏｄａｓｔｈｅ
ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ
，ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒａｔｅｓｏｆｓｔａｎｄａｒｄｓｔｒａｉｎｓｏｆｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｐａｔｈｏｇｅｎｓａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｓｐｅｃｉｍｅｎｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄａｎｄｃｏｍｐａｒｅｄｂｅｔｗｅｅｎｍｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰＣＲａｓｓａｙａｎｄｔｈｅｒｍｏｓｔａｔｉｃｃｈｉｐｍｅｔｈｏｄ．
Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｈｉｐｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰＣＲａｓｓａｙｈａｄｈｉｇｈｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄ
ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ
，ａｎｄｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｐａｔｈｏｇｅｎｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｗｏｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐ＞０．０５）．Ｍｏｒｅｏｖｅｒｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｓｉｎｇｌｅｐａｔｈｏｇｅｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｗｏｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐ＞０．０５）．Ｔｈｅｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙａｎａｌｙｓｉｓ（Ｋａｐｐａｖａｕｌｅ）ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｗｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ（Ｋａｐｐａ＞０．７５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰＣＲａｓｓａｙｉｓｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｃｈｉｐｍｅｔｈｏｄ，ｗｈｉｃｈｈａｓｂｅｔｔｅｒａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｖａｌｕｅｉｎｄｅｔｅｃｔｉｎｇｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｐａｔｈｏｇｅｎｓ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】 ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ；ｐａｔｈｏｇｅｎｓ；ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰＣＲ；ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｈｉｐｍｅｔｈｏｄ
呼吸道感染是常见多发流行病，具有来源复杂，感染力强，感染发病急，潜伏期短，传播快等特点，
严重威胁着人们的健康和生活质量。不同的呼吸道病原体感染，其临床症状极为相似，尤其是在不明原因呼吸道疾病爆发时，有效、快速的鉴别患者感染呼吸道病原体的类型对临床早期诊断和至关重要。传统的呼吸道病原体检测方法主要是细菌培养和血清学检测，由于其操作复杂、检测灵敏度低且检测时间长无法满足快速诊断的要求。近年来分子生物学技术以其高敏感
度、高特异度且操作快速简便等优点，已经成为快速诊
断呼吸道病原体的首选方法［１－３］
，且多重病原体检测
系统也越来越普及，博奥生物呼吸道病原菌核酸检测为国内运用较多的呼吸道病原体检测试剂盒，是一种基于恒温扩增微流控芯片技术，利用链置酶（Ｂｓｔ酶）在恒温（６５℃）条件下进行反应和实时荧光分析，一步
塑料袋泳衣完成对靶基因的扩增和检测，简单易行［４］。本研究采用多重ＰＣＲ检测体系［５］和恒温芯片法检测呼吸道病
原体核酸，比较两种方法对呼吸道病原体的检测效能，评估多重ＰＣＲ体系在呼吸道病原体诊断中的价值。１ 资料与方法
１．１ 一般资料 收集我院２０１７年１月至２０１７年５月诊断为下呼吸道感染或肺炎的新入院患者，符合以下症状：出现咳嗽、咳痰、痰液粘稠，肺部出现湿 音并
伴有发热或白细胞总数和嗜中性粒细胞比例增高等。共收集合格痰液标本１２３例，其中男８１例，女４２例；年龄１６～８８岁，平均年龄（４９．５５±６．５１）岁。痰合格标准：白细胞数＞２５／低倍视野且上皮细胞＜１０／低倍视野，样本量≤０．６ｍｌ，置于样本收集管内，立即保存于４℃冰箱，２４ｈ内检测，未及时检测的样本于－７０℃冰箱保存。
１．２ 试剂和仪器 Ⅱ级生物安全柜（ｅｓｃｏ，型号ＬＢ２ ４Ｂ１）；低温高速离心机（艾本德型号５４２４Ｒ）；全自动实时荧光定量ＰＣＲ仪（美国伯乐，型号ＣＦＸ９６ＤｅｅｐＷｅｌｌ）；全自动核酸提取仪（德国凯杰，型号ＱＩＡｃｕｂｅｃｏｎｎｅｃｔ）；核酸提取试剂盒（ＱＩＡａｍｐＤＮＡＭｉｎｉＫｉｔ，德国凯杰生物公司）；恒温扩增芯片核酸分析仪（ＲＴｉｓｏｃｈｉｐ Ａ，博奥生物）；微量移液器（德国艾本德公司）；呼吸道病原菌核酸检测试剂盒（恒温芯片法，博奥生物，货号３０２０１０）。
１．３ 菌株来源 呼吸道病原体菌株来源于实验室标准菌株以及本院检验科微生物室分离培养，包括铜绿假单胞菌（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｐａｅ）、肺炎链球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｓｐｎ）、金黄葡萄球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ，Ｓａｕ）、肺炎克雷伯菌（ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｋｐｎ）、结核分枝杆菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，ＭＴＢ）、流感嗜血杆菌（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ，Ｈｉｎ）。整个过程按照国家传染性病原体的安全操作规范进行。
１．４ 核酸提取 痰液标本采用消化液（４％ＮａＯＨ溶液）消化１５～３０ｍｉｎ至痰液呈水样，若消化不完全可适当延长消化时间，采用ＤＮＡ提取试剂盒（ＱＩＡａｍｐＤＮＡＭｉｎｉＫｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ），根据试剂盒提取说明书，采用全自动核酸提取仪提取核酸，提取的核酸立即检测，若２４ｈ内能检测置于－２０℃冰箱保存，若长期保存需置于－７０℃冰箱。
１．５ 恒温扩增芯片法检测 采用呼吸道病原菌核酸检测试剂盒（恒温扩增微流控芯片法），根据说明书配制扩增试剂，体系如下：２０μｌ检测缓冲液（包含检测引物及酶液等）和３６．５μｌ呼吸道病原体核酸，涡旋震荡，瞬时离心之后加入检测芯片，上机检测，反应程序如下：３７℃３ｍｉｎ，６５℃１ｍｉｎ（采集荧光信号），扩增４５个循环。
１．６ 多重ＰＣＲ检测 参照邸红芹等［５］构建的呼吸道多重ＰＣＲ扩增体系进行检测，反应体系如下：反应液（ＴａｑｍａｎＦａｓｔＶｉｒｕｓＯｎｅ ｓｔｅｐＭａｓｔｅｒＭｉｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１３．５μｌ，各引物／探针（终浓度为０．４μｍｏｌ／Ｌ）１．５μｌ以及１０μｌ
核酸。然后将各反应管按以下程序在实时荧光ＰＣＲ仪（Ｒｏｃｈｅ４８０）上进行ＰＣＲ反应：５０℃，１５ｍｉｎ（逆转录反应）；９５℃，１０ｍｉｎ（热启动）；９５℃，１５ｓ（变性），６０℃，４５ｓ（退火／延伸，采集荧光信号），扩增３５个循环。
１．７ 结果判定 ＰＣＲ扩增结束后，使用荧光定量ＰＣＲ仪自带软件进行结果分析，所有阴性样本的信号值都应低于阈值；当Ｃｔ值＞３５时，样本低于检测阈值线，结果判定为呼吸道病原体核酸阴性；当Ｃｔ值≤３５时，结果判定为呼吸道病原体核酸阳性。恒温扩增芯片法扩增阳性的样品会产生类似实时荧光的“Ｓ”形扩增曲线，进一步完成对靶基因的扩增和检测，每张芯片内均设有１个阳性质控和９个阴性质控，采用ＲＯＣ法计算得到待检病原菌的阳性判断值，通过检测软件自动判读，当检测指标的Ｔｐ值≤该指标的阳性判断值且阳性质控和阴性质控均正常时，判读为呼吸道病原体核酸阳性；当检测指标的Ｔｐ值＞该指标的阳性判断值且阳性质控和阴性质控均正常时，判读为呼吸道病原体核酸阴性。
１．８ 统计学分析 应用ＳＰＳＳ１３．０统计软件，计量资料以珋ｘ±ｓ表示，采用ｔ检验，计数资料采用χ２检验，一致性分析采用Ｋａｐｐａ检测，Ｋａｐｐａ＜０．４０时为低度一致性，０．４０≤Ｋａｐｐａ≤０．７５时为中度一致性，０．７５≤Ｋａｐｐａ≤１．００时为高度一致性，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
２ 结果
２．１ 检测结果判定 ＰＣＲ扩增结束后，采用机器自带软件进行扩增图片分析，相应的检测通道显示各类呼吸道病原体核酸扩增结果，以流感嗜血杆菌（ＨＩＮ）核酸扩增检测为例，呈“Ｓ”型扩增曲线，阴阳性质控都在控，显示检测有效。见图１
。
图１ 呼吸道病原体核酸检测扩增曲线；Ａ多重荧光定量ＰＣＲ法检测流感嗜血杆菌核酸扩增曲线；Ｂ恒温芯片法检测流感嗜血杆菌核
酸扩增曲线，红曲线为扩增曲线，另外两条扩增曲线为外质控
和阳性对照
２．２ 多重荧光定量ＰＣＲ法性能评估 采用多重荧光定量ＰＣＲ法和恒温芯片法同时对呼吸道病原体标准菌株（包括铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、金黄葡萄球
菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌、流感嗜血杆菌）进行检测，以恒温芯片法检测为金标准，结果显示多重荧光定量ＰＣＲ法各个检测通道无相互干扰，具有很高的一致性和特异性。见表１。
表１ 多重荧光定量ＰＣＲ与恒温芯片法一致性和特异性分析
菌株
恒温芯片法
ＰａｅＳｐｎＬｐｎＳａｕＫｐｎＭＴＢＨｉｎ
多重荧光定量ＰＣＲ法Ｐａｅ＋－－－－－－Ｓｐｎ－＋－－－－－Ｌｐｎ－－＋－－－－Ｓａｕ－－－＋－－－Ｋｐｎ－－－－＋－－ＭＴＢ－－－－－＋－Ｈｉｎ－－－－－－＋
２．３ 临床样本检测结果分析 多重荧光定量ＰＣＲ法和恒温芯片扩增法同时对１２３例呼吸道疾病患者痰液标本检测结果显示，恒温芯片法检出阳性率为４３．０９（５３／１２３），多重荧光定量ＰＣＲ法检出阳性率为４７．１５％（５８／１２３），差异无统计学意义（χ２＝０．４１０，Ｐ＝０．５２２）。多重荧光定量ＰＣＲ法与恒温芯片法对常见呼吸道病原体如：铜绿假单胞菌（χ２＝０．２００，Ｐ＝０．６５５）、肺炎链球菌（χ２＝０．０６３，Ｐ＝０．８０２）、金黄葡萄球菌（χ２＝０．０６３，Ｐ＝０．８０２）、肺炎克雷伯菌（χ２＝０．０４８，Ｐ＝０．８２７）、结核分枝杆菌（χ２＝０．４７８，Ｐ＝０．６８９）、流感嗜血杆菌（χ２＝０．１８５，Ｐ＝０．６６７）的检测结果显示，多重荧光定量ＰＣＲ法和恒温芯片扩增法的检出率差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。一致性分析显示多重荧光定量ＰＣＲ法和恒温芯片扩增法对常见呼吸道病原体检测，包括：铜绿假单胞菌（Ｋａｐｐａ＝０．９００）、肺炎链球菌（Ｋａｐｐａ＝９３７）、金黄葡萄球菌（Ｋａｐｐａ＝０．９３７）、肺炎克雷伯菌（Ｋａｐｐａ＝０．９５２）、结核分枝杆菌（Ｋａｐｐａ＝０．８５４）及流感嗜血杆菌（Ｋａｐｐａ＝０．９０８）均具有高度一致性（Ｋａｐｐａ均＞０．７５）。见表２。
表２ 多重荧光定量ＰＣＲ与恒温芯片法对呼吸道病原体检出比较
多重荧光定量ＰＣＲ法
恒温芯片法
阳性阴性
χ２检验
χ２值Ｐ值
Ｋａｐｐａ检验
ＫａｐｐａＰ值
特异度（％）敏感度（％）
ＰａｅＳｐｎＳａｕＫｐｎＭＴＢＨｉｎ阳性１０２
阴性０１１１
阳性８１
阴性０１１４
阳性８０
阴性１１１４
阳性１１０
阴性１１１１
阳性１８４
阴性０１０１
汽车报警系统阳性１１０
阴性２１１０
０．２０００．６５５０．９００１．０８Ｅ－２３９８．２３１００
０．０６３０．８０２０．９３７２．２２Ｅ－２５９９．１３１００
０．０６３０．８０２０．９３７２．２２Ｅ－２５１００８８．８９
０．０４８０．８２７０．９５２４．０７Ｅ－２６１００９１．６７
０．４７８０．６８９０．８５４１．３４Ｅ－２１９６．１９１００
０．１８５０．６６７０．９０８４．９７Ｅ－２４１００８４．６２
３ 讨论
引起呼吸道感染的病原体种类多且症状大多相似，临床医生很难准确诊断病因，因此，快速、准确检测出患者所感染的呼吸道病原体尤为重要。近年，适用于检测病原体的分子生物学技术不断涌现，核酸检测技术由于其高敏感性、便捷性和简便性，越来越多的用于临床实验室呼吸道病原体的常规诊断，如荧光定量ＰＣＲ［６－８］、恒温扩增技术［９－１２］以及芯片技术［１３－１５］、测序技术［１６－１８］等。呼吸道病原体的高通量检测也越来越普及，其中比较常用的有多重荧定量ＰＣＲ法、恒温微流控芯片法以及测序法。徐嘉楠等［１９］运用多重ＰＣＲ技术联合熔解曲线（Ｔｍ）快速检测并区分２２种呼吸道感染相关的病原体，结果显示这种基于多重ＰＣＲ技术的检测试剂盒不仅极大缩短检测时间，得到较高的阳性率，且其操作技术也较常规方法更简便；李艳燕等［２０］采用基于环介导等温扩增技术（ＬＡＭＰ）结合微流控芯片，进行１３种常见下呼吸道病原体检测，该方法简单快速、试剂耗量低、自动化程度高，提高了检测敏感性，具备了对呼吸道感染性疾病的快速诊断能力，极大缩短了检验周期。吕园等［２１］对１３种呼吸道病原体多重检测试剂（ＰＣＲ毛细管电泳片段分析方法）进行性能验证，证实该试剂盒满足交叉反应、符合率及抗干扰能力等要
求，可用于临床呼吸道样本的检测。可见核酸检测技术的应用将成为广谱呼吸道病原体检测的新方向。
本研究将多重ＰＣＲ与荧光定量ＰＣＲ相结合建立多重荧光定量ＰＣＲ（ＭＲＴ ＰＣＲ）体系，针对呼吸道病原体核酸序列的保守区设计特异性引物和荧光探针，同带式输送机传动滚筒
时综合两种检测方法的优点能够快速、高通量的检测常见的呼吸道病原体［５］。以恒温芯片法为参照［２２，２３］，一致性分析显示多重荧光定量ＰＣＲ体系间各检测通道干扰，具有很高的特异性（表１）。同时，对１２３例呼吸道疾病患者痰液标本检测结果显示，恒温芯片法检出阳性率为４３．０９％（５３／１２３），多重荧光定量ＰＣＲ法检出阳性率为４７．１５％（５８／１２３），差异无统计学意义（χ２＝０．４１０，Ｐ＝０．５２２），显示多重荧光定量ＰＣＲ可用于呼吸道病原体的检测。
本研究对两种方法的操作简便性和时效性进行比较，两种方法样本处理及核酸提取的过程相同，结果判读都是根据Ｃｔ值。恒温芯片检测试剂盒一次能同时检测１３种病原体，但每次只能检测１个样本；多重荧光定量ＰＣＲ法一次能同时检测１５种病原体，每次检测量依据ＰＣＲ仪的通量而定，每份样本需要１个八联排ＰＣＲ管。操作步骤方面，恒温芯片检测试剂盒操作较简便，仅需一步操作即可完成；而多重荧光定量ＰＣＲ需要配置多个试剂盒，需要手工操作的步骤比较多。仪器要求方面，
恒温芯片检测试剂盒完成所有病原体的检测需要相应的恒温检测仪，１ｈ以内即可完成，但如果需要同时检测多个样本，则需要增加仪器的数量；多重荧光定量ＰＣＲ法需要ＰＣＲ仪，２．５～３ｈ完成检测，仪器越多或通量越大检测样本数量越多。因此，在实际应用中，可根据实际情况来选择合适的检测方法。
本研究将与恒温芯法检测试剂盒共有的７种常见呼吸病原体：铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、金黄葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、军团菌、结核分枝杆菌、流感嗜血杆菌进行检测性能分析。多重荧光定量ＰＣＲ法和恒温芯片法对铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、金黄葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌、流感嗜血杆菌的阳性检出分别为１２例（９．７６％）、９例（７．３２％）、８例（６．５０％）、１１例（８．９４％）、２２例（１７．８９％）、１１例（８．９４％）和１０例（８．１３％）、８例（６．５０％）、９例（７．３２％）、１２例（９．７６）、１８例（１４．６３％）、１３例（１０．５７％），同时对阳性检出进行统计学分析，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），一致性分析Ｋａｐｐａ值显示两种检测方法具有高度一致性（Ｋａｐｐａ＞０．７５）。本研究因未评估多重荧光定量ＰＣＲ体系中其他病原体如流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒以及冠状病毒的检测性能，具有一定的局限性，同时增加样本量并应采用更多相似的商品化检测试剂盒进行进一步地性能验证。
综上所述，构建多重荧光定量ＰＣＲ体系与恒温芯片检测法对常见呼吸道病原体的检测敏感性和特
异性相近，可用于快速、高通量筛查多种呼吸道病原体，具有良好的应用前景。
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（收稿日期：２０２０－１０－１１）
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