基于细胞分选与微流控电融合技术的单克隆抗体制备方法

1.本发明涉及单克隆抗体制备技术领域，具体地说，涉及一种基于细胞分选与微流控电融合技术的单克隆抗体制备方法。

背景技术：

2.单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高、均一性好等优点，已被广泛应用于抗体、诊断检测、生物成像等研究领域。1975年kohler和milstein等人创建了鼠源杂交瘤技术，并于1984年获得了诺贝尔医学奖。从此，基于杂交瘤的抗体制备研究工作得到了迅速的发展，产生了巨大的科学价值和经济效益。单克隆抗体的制备通常是对小鼠进行免疫后，取其脾脏细胞，并将该细胞与骨髓瘤细胞进行融合制备杂交瘤细胞。随后采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的多轮筛选，获得能产生抗原特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞，最后采用小鼠体内诱生腹水法或细胞体外培养法制备单克隆抗体。
3.小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞的融合是制备高性能单克隆抗体的第一步也是最为关键的一步。能否对可分泌抗体的淋巴细胞和可无限增殖的骨髓瘤细胞进行高效且精准的融合，将直接决定后续获得单克隆抗体的成功率。然而传统细胞融合步骤存在以下两个关键点：第一，通常将小鼠最重要的免疫器官——脾脏作为淋巴细胞的来源用于后续融合。然而研究表明小鼠的脾脏中细胞种类繁多，包含多种亚。其中具备分泌大量高亲和力抗体的浆细胞仅占脾脏总细胞数的0.9％～1.2％。因此，直接将脾脏中所有细胞与骨髓瘤细胞进行融合时会产生大量的无用融合细胞，真正形成的有效融合细胞(浆细胞与骨髓瘤细胞融合)占比将极低。第二，传统融合通常采用基于peg (polyethylene glycol)的化学融合法进行淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合。然而该方法存在细胞数量需求大、化学试剂细胞毒性强、实验操作难度高以及难以获得抗膜蛋白抗体等难题。
4.随着细胞分选技术的发展，利用细胞表面特异性标志物(cd marker)的流式分选和基于纳米免疫磁珠的亲和分离等手段，可为不同脾细胞亚型的高效分选提供良好的技术平台。利用浆细胞表面表达的cd138
+
marker，采用cd138标记磁珠对浆细胞进行特异性亲和，再将细胞-磁珠悬浮液放置于磁场中即可实现稀有浆细胞的有效分选。通过浆细胞的精准分选可以排除脾细胞中大量的无用细胞亚型，可实现低丰度、有效细胞(稀有浆细胞)的高效富集。再将其与骨髓瘤细胞进行融合，克服了传统细胞融合时的盲目性，能够大幅提升有效细胞的融合率。
5.然而，在进行了浆细胞的精准分选后，其细胞数量将大幅下降。小鼠脾脏中浆细胞的数量决定了其无法沿用前期常规的peg化学法进行后续融合。核心原因在于浆细胞总数量少(《105个)，体积小(《50μl)，故难以进行与骨髓瘤细胞的融合实验操作。细胞电融合是二十世纪八十年代发展起来的一门新兴的细胞工程技术，由于其具有融合效率高、细胞毒性小、可控性强等优势，已成为现代生物医学研究的一项重要技术。该技术已被应用于生物育种、细胞克隆、靶向药研发等领域。此外，微流控技术 (microfludics)的特点是其微纳尺寸下具有独特的流体性质并可以实现单细胞水平的精准控制。因此，利用微流控技术可以
实现一系列常规方法难以完成的细胞微操作，如在微纳结构中对细胞进行有序排列、微环境中进行细胞的电学刺激等。将细胞电融合与微流控技术进行结合，能在微升甚至纳升的微腔室中对微量细胞进行精准电学操控，可以实现常规细胞融合实验中无法实现的精准操作。
6.因此，为单克隆抗体的研发建立高效的杂交瘤制备方式，亟需开发一种微量细胞的电融合平台，利用该平台进行稀有有效细胞与瘤细胞的高效融合，精准制备高性能杂交瘤。

技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种基于细胞分选与微流控电融合技术的单克隆抗体制备方法。
8.为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种基于细胞分选与微流控电融合技术的单克隆抗体制备方法，包括以下步骤：
9.1)针对小分子化合物m，设计并合成人工抗原；
10.2)用人工抗原免疫实验动物，分离获得淋巴细胞；
11.3)用免疫磁珠法对步骤2)的淋巴细胞进行分选，获得稀有浆细胞；
12.4)将步骤3)分选的稀有浆细胞与骨髓瘤细胞混合，采用微流控电融合芯片进行细胞融合，从融合细胞中筛选出分泌抗小分子化合物m的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
13.在本发明的一个具体实施方式中，所述小分子化合物m为afm1(黄曲霉毒素 m1)，结构如式i所示：
[0014][0015]
所述人工抗原为afm1与载体蛋白的偶联物，
[0016]
所述载体蛋白可选自牛血清白蛋白、血蓝蛋白(klh)、卵清蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白等。
[0017]
优选地，所述人工抗原为afm1-klh。
[0018]
进一步地，步骤2)所述实验动物为小鼠，从小鼠脾脏中分离淋巴细胞。
[0019]
进一步地，步骤3)包括：利用浆细胞表面特异性标志物，设计并合成可特异性识别所述标志物的免疫磁珠，对淋巴细胞进行分选，获得稀有浆细胞。
[0020]
优选使用美天旎生物科技有限公司的cd138磁珠。
[0021]
步骤4)将分选的稀有浆细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0按照1:(0.2-5)的比例混合，细胞总数为2
×
10
3-2
×
106进行电融合。
[0022]
优选地，将分选的稀有浆细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0按照1:0.2、1:0.5、1:1、1:2 或1:5的比例混合，细胞总数为2
×
104进行电融合。
[0023]
电融合分为三个阶段：排队阶段、融合阶段和修复阶段；
[0024]
排队阶段电压设置为15-40v，时间为10-50s，频率为0.8-1.8mhz；
[0025]
融合阶段电压设置为30-100v，电穿孔1-3次，时间为20-100μs；
[0026]
修复阶段电压设置为30v逐渐降至5v，时间为10-60s。
[0027]
优选地，排队阶段电压设置为15v、20v、25v、30v、35v或40v，时间为10s、 20s、30s、40s、50s或60s，频率为0.8mhz、1.0mhz、1.2mhz、1.4mhz、1.6mhz 或1.8mhz；
[0028]
融合阶段电压设置为30v、40v、50v、60v、70v、80v、90v或100v，时间为 20μs、40μs、60μs、80μs或100μs；
[0029]
修复阶段电压设置为30v逐渐降至5v，时间为10s、20s、30s、40s、50s或60s。
[0030]
更优选地，排队阶段电压设置为30v，时间为30s，频率为1.4mhz；
[0031]
融合阶段电压设置为60v，电穿孔1次，时间为40μs；
[0032]
修复阶段电压设置为30v逐渐降至5v，时间为30s。
[0033]
第二方面，本发明提供按照所述方法制备的杂交瘤细胞。
[0034]
第三方面，本发明提供一种抗afm1单克隆抗体，由保藏编号为cgmcc no. 45242的小鼠杂交瘤细胞株afm1分泌产生。该杂交瘤细胞株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号cgmcc no.45242，保藏日期2022年7月 29日。
[0035]
第四方面，本发明提供由所述单克隆抗体制备的afm1检测试剂或试剂盒。
[0036]
第五方面，本发明提供所述单克隆抗体的以下任一应用：
[0037]
(1)用于afm1检测；
[0038]
(2)用于制备afm1检测试剂或试剂盒；
[0039]
(3)用于制备检测afm1的免疫层析试纸条。
[0040]
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
[0041]
本发明针对传统细胞融合过程的存在不确定性与有效融合率低的问题，在细胞融合之前基于特异性磁珠将小鼠脾脏中b淋巴细胞进行富集。将获得了稀有浆细胞与小鼠骨髓瘤细胞(sp2/0)进行微流控芯片电融合，此方法较为新颖，且操作步骤相对简单，为高性能单克隆抗体的精准制备奠定基础，从而制备出特异性强、灵敏度高的黄曲霉毒素m1单克隆抗体。该技术在科研与实际生产中具有广阔的应用前景。
附图说明
[0042]
图1为本发明较佳实施例中细胞在不同电压条件下排队情况。其中，a-f：排队电压分别为15v、20v、25v、30v、35v、40v。
[0043]
图2为本发明较佳实施例中细胞在60v电压条件下融合成功后生长情况。其中， a-c分别为细胞融合后0天、5天、10天生长状态。
[0044]
图3为本发明较佳实施例中afm1单克隆抗体标准曲线。
[0045]
图4为本发明较佳实施例中抗体对盐离子耐受性测定结果。
[0046]
图5为本发明较佳实施例中抗体对甲醇耐受性测定结果。
[0047]
图6为本发明较佳实施例中抗体对乙腈耐受性测结果。
[0048]
图7为本发明较佳实施例中抗体对ph耐受性测定结果。
具体实施方式
[0049]
本发明基于小鼠脾脏中b淋巴细胞表面特异性标志物，同时借助磁珠分选的方法分别进行小鼠脾脏中淋巴细胞和稀有浆细胞的逐级分选，开发了一种高效且精准的小鼠脾脏中稀有b淋巴细胞的分选技术。随后采用微流控芯片进行稀有、微量细胞的电融合，获得了，设计合理的实验方法，为精准制备单克隆抗体奠定基础。本发明以黄曲霉毒素m1(aflatoxin m1，afm1)(式i)为模式分子，以balb/c小鼠为模式动物。
[0050]
本发明提供一种黄曲霉毒素m1免疫原免疫balb/c小鼠的方法。
[0051]
本发明还提供一种小鼠脾脏淋巴细胞分离的方法。
[0052]
本发明还提供一种小鼠脾脏中稀有浆细胞的分选方法。
[0053]
本发明还提供一种将微流控芯片用于微量细胞电融合的方法。
[0054]
本发明还提供一种基于微流控芯片的电融合杂交瘤制备方法。
[0055]
本发明还提供一种稀有浆细胞来源的黄曲霉毒素m1单克隆抗体的elisa鉴定方法。
[0056]
本发明采用如下技术方案：
[0057]
1、免疫原合成
[0058]
黄曲霉毒素m1免疫原afm1-klh的制备方法如下：采用羧甲基羟胺法合成afm1 人工抗原。
[0059]
2mg afm1经羧甲基羟胺(cmo)活化生成afm1-cmo，活化后的afm1-cmo 溶于2ml dmf,1.8mg nhs溶于200μl dmf,3mg nhs溶于400μl dmf，三者混匀，室温震荡孵育4h。将其中1.5ml反应液缓慢滴加到25mg klh中，室温震荡孵育14h，制备afm1-klh作为免疫原。透析所得溶液并分装，-20℃保存。
[0060]
2、免疫方式
[0061]
免疫制剂的制备方法如下：将afm1-klh(浓度1.963mg/ml)与完全弗氏佐剂/不完全弗氏佐剂等体积混合并乳化。
[0062]
免疫方式如下：颈背部皮下多点注射免疫法。免疫的次数为3次，第一次免疫为初次免疫、采用弗氏完全佐剂佐剂，其他免疫均采用弗氏不完全佐剂。所述方法中，免疫原的剂量为50μg，免疫周期为21天，每免疫一周后，眼眶下丛静脉采血100μl，用于血清分离和血清亲和力的检测。
[0063]
3、抗血清的筛选鉴定
[0064]
4、脾细胞分离
[0065]
小鼠脾细胞分离的方法：第3次免疫完，选取血清亲和力高的小鼠进行腹腔冲击免疫，加强免疫3天后进行脱颈处死，在无菌条件下，取出脾脏，将脾脏放在0.45μm的滤网中，加入1ml红细胞裂解液，用灭菌的玻璃研杵，研磨，过滤离心后，定容于20 ml培养基中，用于后续的脾脏淋巴细胞的分离。
[0066]
5、淋巴细胞分离
[0067]
小鼠脾脏淋巴分离的方法：在细胞悬浮液上方轻轻加入等体积的淋巴细胞分离液，置于整体体积3倍的离心管中1000g水平离心30min，取中间层的淋巴细胞，洗涤三次后，用含10％血清的dmem培养基重悬并进行计数。
[0068]
6、稀有浆细胞分离
[0069]
小鼠脾脏中稀有浆细胞的方法：基于浆细胞表面标志物(b220+cd27-cd138+)，利用免疫磁珠分选方法进行b淋巴细胞亚中浆细胞的分选，洗涤三次后，用含10％血清的dmem培养基重悬并进行计数。免疫磁珠为cd138磁珠，购自美天旎生物科技有限公司。
[0070]
7、制备微流控电融合芯片
[0071]
8、稀有浆细胞的微流控芯片电融合
[0072]
采用微流控电融合芯片进行细胞融合的方法：利用商业化的btx 40μl电融合池 (电极间距为1mm)将分选的将细胞与sp2/0细胞按照1:1比例混合，细胞总数为2
×
104进行电融合。电融合分为三个阶段：排队阶段、融合阶段、修复阶段。排队阶段电压设置为30v，时间为30s，频率为1.4mhz；融合阶段电压设置为60v，电穿孔1次，时间为40μs；修复阶段电压设置为30v逐渐降至5v，时间为30s。
[0073]
9、杂交瘤筛选及单克隆抗体鉴定。
[0074]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0075]
实施例1 balb/c小鼠的免疫
[0076]
针对基于小鼠脾脏细胞中浆细胞cd marker借助磁珠分选方法分别进行小鼠脾脏中稀有浆细胞的分选，建立一种高效、精准分选小鼠脾脏细胞技术，结合电融合技术，设计合理的实验方法，为精准制备单克隆抗体奠定基础。本实施例以黄曲霉毒素m1 (afm1)(式1)为模式分子，以balb/c小鼠为模式动物。
[0077]
balb/c小鼠的免疫方法如下：
[0078]
用pbs缓冲液稀释免疫原(afm1-klh)，用nanodrop测得免疫原终浓度为2.0 mg/ml，
[0079]
取8只balb/c小鼠，编号分别为afm1-klh-1、afm1-klh-2、afm1-klh-3、 afm1-klh-4、afm1-klh-5、afm1-klh-6、afm1-klh-7和afm1-klh-8。对balb/c 小鼠进行3次免疫，免疫方式为颈背部皮下免疫4-8点。
[0080]
每次免疫原afm1-klh的剂量为50μg，免疫周期为30天，每次免疫1周后，进行血清效价和亲和力的检测，共免疫3次。
[0081]
实施例2 balb/c小鼠抗血清的筛选与鉴定
[0082]
对免疫后一周所获得的抗血清进行效价和灵敏度的测定。测定方法为间接elisa。
[0083]
间接elisa步骤具体为：
[0084]
将包被原afm1-bsa(浓度为1.668mg/ml)用碳酸盐缓冲液(ph9.6)稀释为 0.1668μg/ml，以100μl/孔的量包被elisa板，37℃孵育2h，然后用pbst溶液洗板 3次。酪蛋白封闭elisa板(150μl/孔)，37℃孵育1h，然后用pbst溶液洗涤3次，拍干。将抗血清用pbs进行梯度稀释，稀释成1:1000、1:5000、1:20000。在包被好的 elisa板中加入50μl pbs缓冲液和50μl梯度稀释的抗血清溶液，37℃温箱孵育30 min，然后用pbst溶液洗涤3次，拍干。每孔加入100μl酶标二抗稀释液(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗)，37℃孵育30min，然后用pbst溶液洗涤3次，拍干。每孔加入100μl显液(2％3,3’,5,5
’‑
四甲基联苯胺溶液和30％过氧化氢等体积混合)， 37℃孵育15min。每孔加入50μl 2mol/l浓硫酸。以od450 nm波长测定各孔od值，当od值为1.5-2.0时的抗体的最高稀释倍数即为抗体效价。选取效价最高、抑制效果最好的小鼠进行冲击。
[0085]
实施例3小鼠脾脏细胞的分离
[0086]
小鼠脾细胞分离的方法：第3次免疫完，选取血清亲和力高的小鼠进行腹腔冲击免疫，加强免疫3天后进行脱颈处死，在无菌的条件下，取出脾脏，将脾脏放在0.45 μm的滤网中，加入1ml红细胞裂解液，用灭菌的玻璃研杵，研磨，过滤离心后，定容于20ml培养基中，用于后续的脾脏淋巴细胞的分离。具体方法如下：
[0087]
(1)第3次免疫3周后，进行腹腔冲击加强免疫，冲击剂量为150μg，冲击完3-4 天，在无菌的条件下，摘取小鼠的脾脏，去除上面多余的脂肪和纤维组织。
[0088]
(2)准备1个9cm一次性培养皿和1个45μm的无菌滤网，将脾脏放入无菌滤网中用灭菌玻璃芯进行轻轻研磨以充分游离脾细胞，并在研磨过程中加入1ml红细胞裂解液，研磨完毕用约10ml的dmed悬浮脾细胞。
[0089]
(3)将滤膜放置50ml离心管口，将脾细胞悬液缓慢通过滤膜移入50ml离心管，补dmem培养基至30ml，1000rpm离心6min。离心完毕后，将细胞轻轻弹起，加入约 2ml的deme培养基，将结块的细胞用移液器吸出直至无大块脾细胞存在。补充 deme培养基至10ml，即得到脾细胞悬液，用细胞计数仪计数。
[0090]
实施例4小鼠脾脏中淋巴细胞的分离
[0091]
小鼠脾脏淋巴分离的方法：在细胞悬浮液上方轻轻加入等体积的淋巴细胞分离液，置于整体体积3倍的离心管中1000g水平离心30min，取中间层的淋巴细胞，洗涤三次后，用含10％血清的dmem培养基重悬并进行计数。具体方法如下：
[0092]
(1)制备小鼠脾脏的单细胞悬液。
[0093]
(2)取一支适当的离心管，加入与脾脏单细胞悬液等量的分离液(分离液最少不得少于3ml，总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果)。
[0094]
(3)小心吸取单细胞悬液加于分离液液面上，注意保持两液面界面清晰。(可以使用巴氏德吸管吸取单细胞悬液，然后小心地平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面)
[0095]
(4)1500g离心25min后，此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层为稀释液层；第二层为环状乳白淋巴细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层。
[0096]
(5)用吸管小心吸取第二层环状乳白淋巴细胞至另一洁净的15ml离心管中，向离心管中加入10ml细胞洗涤液洗涤白膜层细胞，250g离心10min。
[0097]
(6)弃上清，5ml的pbs或细胞清洗液重悬细胞，250g离心10min。
[0098]
(7)重复步骤(6)。
[0099]
(8)弃上清，细胞重悬备用。
[0100]
(9)细胞计数仪计数。
[0101]
实施例5小鼠脾脏中稀有浆细胞的分离
[0102]
小鼠脾脏中浆细胞的方法：基于浆细胞表面标志物(b220+cd27-cd138+)，借助美天旎磁珠分选方法进行b淋巴细胞亚中浆细胞的分选，洗涤三次后，用含10％血清的dmem培养基重悬并进行计数。具体方法如下：
[0103]
(1)制备小鼠脾脏淋巴细胞的单细胞悬液。
[0104]
(2)取107个细胞进行密度梯度离心，300g离心10min，用40μl pbs重悬，加入10μl cd138磁珠，混合后置于4℃孵育15min。
[0105]
(3)将磁分离柱置于合适的macs分离器中，将步骤(2)中标记好的细胞悬液缓慢加入磁分离柱中，用1ml ep管收集穿柱液，然后将macs分离器从磁分离柱上移除，收集吸附在柱子上的细胞，该步骤所得的细胞即为稀有浆细胞。
[0106]
(4)细胞计数仪计数。
[0107]
实施例6 40μl微流控电融合芯片进行稀有浆细胞与sp2/0细胞融合
[0108]
采用微流控电融合芯片进行细胞融合的方法：利用商业化的btx 40μl电融合池 (电极间距为1mm)将分选的将细胞与sp2/0细胞按照1：1比例混合，细胞总数为2
×
104进行电融合。电融合分为三个阶段：排队阶段、融合阶段、修复阶段。排队阶段电压设置为30v、时间为30s、频率为1.4mhz；融合阶段电压设置为60v、电穿孔1次，时间为40μs；修复阶段电压设置为30v逐渐降至5v，时间为30s。具体方法如下：
[0109]
(1)利用商业化的btx 40μl电融合池(电极间距为1mm)将分选的稀有浆细胞与sp2/0细胞按照1:1比例混合，调整细胞总数为2
×
104个。
[0110]
(2)确定电融合的最佳排队电压：设置6个排队电压，分别为15v、20v、25v、 30v、35v、40v，时间设置为30s，频率设置为1.4mhz。每次取40μl细胞悬液加入电融合池中，观察细胞的排队状况，如图1所示，选取能够使细胞排布规则、长度适中的电压作为排队电压。即30v。
[0111]
(3)确定电融合的最佳融合电压：设置8个融合电压，分别为30v、40v、50v、 60v、70v、80v、90v、100v，设置电穿孔1次，时间为40μs，电融合后将细胞转移至20％hat培养基中，每孔铺2万个细胞，每个电压条件铺4个孔，置于37℃、5％co2培养箱中培养10天。5天后观察每个条件电压下杂交瘤细胞的生长状态，仅在60v作为融合电压时长出了克隆(图2)，其他电压条件下均为未长团。因此，将60v作为细胞的融合电压。
[0112]
(4)电融合修复阶段电融合参数设置：修复阶段电压设置为30v逐渐降至5v，时间为30s。
[0113]
实施例7基于淋巴细胞分选制备afm1单克隆抗体
[0114]
(1)根据实施例6确定的最佳电融合参数进行稀有浆细胞与sp2/0细胞融合，将融合后的细胞铺于含饲养细胞的20％hat培养基中，每次融合接种于一块96孔板中的其中4个孔，每孔铺2万个细胞，置于37℃、5％co2培养箱中培养10天。
[0115]
(2)融合的当天计为0天，前5天尽量不要动细胞培养板，保持培养箱内环境稳定。第5天可在显微镜下观察融合细胞集落状态。
[0116]
(3)待融合细胞集落长至培养孔的1/4左右，每孔中取50μl细胞上清进行间接 elisa方法检测。与零孔相比，上清孔od值能被抑制的判为阳性。根据抑制率和细胞集落生长状况，选择仅有1-2个单集落的细胞孔，采用有限稀释方法进行亚克隆。
[0117]
(4)经过3-4次克隆，最终筛选出分泌抗afm1的单克隆抗体杂交瘤细胞株。将该细胞株经腹腔注射balb/c小鼠生产单克隆抗体。采用购自thermo sxientific公司的鼠单克隆抗体快速elisa同型试剂盒对本发明所得到的单克隆抗体的亚型和轻链进行鉴定，结果所获抗体重链亚型为igg1、轻链亚型为igλ。该单克隆抗体由保藏编号为cgmcc no.45242的小鼠杂交瘤细胞株afm1分泌产生。
[0118]
实施例8单克隆抗体性能的鉴定
[0119]
(1)抗原抗体最佳工作浓度的确定
[0120]
选择上述合成的afm1-bsa作为包被原，通过棋盘法确定抗原抗体最佳工作浓度，将afm1-bsa用pbs进行稀释，分别稀释成1:1000、1:3000、1:9000、1:27000、 1:81000、1:243000、1:729000、1:2187000这8个稀释度。将所获得的抗体用pbs进行稀释，分别稀释成1:1000、1:3000、1:9000、1:27000、1:81000、1:243000这6个稀释度。按照实例二中的间接竞争elisa进行操作，最终选取0标od值在1.5-2.0的抗原抗体稀释度作为最佳工作浓度。结果见表1。
[0121]
表1
[0122]
抗原/抗体稀释度1：10001：30001：90001：270001：810001：243001：10003.2642.9322.4011.6780.9620.4221：30003.1442.8092.3741.6240.8470.3671：90002.9162.6002.1551.5380.7140.3071：270002.5502.4041.9941.3030.5970.2971：810002.0381.7621.4490.9280.4720.2381：2430001.3361.0990.8610.5550.3180.2041：7290000.7360.5790.4370.3020.2250.1651：21870000.5200.3650.2900.2280.1900.181
[0123]
(2)标准曲线的建立
[0124]
经验证，最终确定抗原稀释度为1:9000、抗体稀释度为1:27000。按照此稀释度建立标准曲线。将afm1用pbs配制成0、0.00005、0.00017、0.0005、0.0017、0.005、 0.017、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05ng/ml 12个浓度。每个浓度重复3孔，按照间接竞争elisa方法重复测定3次。以黄曲霉毒素m1溶液浓度的对数值为横坐标，od450 nm值为纵坐标绘制标准曲线(图3)，计算出单克隆抗体的ic
50
值为11.97pg/ml。
[0125]
(3)交叉反应率的测定
[0126]
将四种afm1类似物afb1、afb2、afg1、afg2用pbs配制成适当浓度，用建立的elisa方法测定各类似物的ic
50
值，做3组平行实验，以单克隆抗体对afm1的交叉反应率(cr)为100％，利用公式1计算单克隆抗体对各药物的交叉反应率，结果见
[0127]
表2。
[0128][0129]
表2
[0130]
靶标ic
50
(ng/ml)交叉反应率afm10.050100％afb10.5519.1％afb2——afg10.8585.8％afg2——
[0131]
结果表明：单克隆抗体对黄曲霉毒素b1、g1交叉反应率分别为9.1％、5.8％、对 afb2、afg2不识别。
[0132]
实施例9单克隆抗体耐受性的鉴定
[0133]
(1)盐离子耐受浓度测定：配置不同nacl浓度的抗体稀释液，使nacl的终浓度分别为：0、18.125、26.25、72.5、145、290、580以及1160mm，用该系列稀释液将抗体分别稀释至最佳工作浓度，其余步骤按实施例2操作，读取各孔od值、计算ic
50
值(表3)并利用origin软件进行拟合绘制标准曲线(图4)。由图表可知，该抗体可以耐受1160mm的nacl，具有良好的盐离子耐受性能。
[0134]
表3
[0135]
nacl(mm)018.12536.2572.51452905801160od值1.7761.7221.5551.8661.951.5241.3511.248ic
50
值0.0490.02650.02570.03050.03890.01450.02110.0247
[0136]
(2)甲醇耐受含量测定：配置不同甲醇含量的抗体稀释液，使甲醇的终浓度分别为：0％、2.5％、5％、10％、20％、40％、和60％，用该系列稀释液将抗体分别稀释至最佳工作浓度，其余步骤按实施例2操作，读取各孔od值、计算ic
50
值(表4)并利用origin软件进行拟合绘制标准曲线(图5)。由图表可知，该抗体的甲醇耐受性优良，可耐受40％以上的甲醇。
[0137]
表4
[0138][0139][0140]
(3)乙腈耐受含量测定：配置不同乙腈含量的抗体稀释液，使乙腈的终浓度分别为：0％、2.5％、5％、10％、20％和40％，用该系列稀释液将抗体分别稀释至最佳工作浓度，其余步骤按实施例2操作，读取各孔od值、计算ic
50
值(表5)并利用origin 软件进行拟合绘制标准曲线(图6)。由图表可知，该抗体的乙腈耐受性优良，可耐受20％以上的乙腈。
[0141]
表5
[0142]
乙腈浓度(％)02.55102040od值1.3961.3761.5682.1622.3371.476ic
50
值0.02120.03730.1490.528无抑制无抑制
[0143]
(4)ph耐受范围测定：将抗体稀释液的ph调至4、5、6、7、8、9和10。用该系列稀释液将抗体分别稀释至最佳工作浓度，其余步骤按实施例2操作，读取各孔od值、计算ic
50
值(表6)并利用origin软件进行拟合绘制标准曲线(图7)。由图表可知，该抗体的ph耐受性良好，在ph4-10之间表现出良好的耐受性。
[0144]
表6
[0145]
ph45678910od值0.8821.2871.5971.5151.4341.4421.628ic
50
值0.03390.03450.02740.00940.01170.03350.0195
[0146]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：

1.基于细胞分选与微流控电融合技术的单克隆抗体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)针对小分子化合物m，设计并合成人工抗原；2)用人工抗原免疫实验动物，分离获得淋巴细胞；3)用免疫磁珠法对步骤2)的淋巴细胞进行分选，获得稀有浆细胞；4)将步骤3)分选的稀有浆细胞与骨髓瘤细胞混合，采用微流控电融合芯片进行细胞融合，从融合细胞中筛选出分泌抗小分子化合物m的单克隆抗体的杂交瘤细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述小分子化合物m为afm1；所述人工抗原为afm1与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、血蓝蛋白、卵清蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述实验动物为小鼠，从小鼠脾脏中分离淋巴细胞。4.根据权利要求3所述的方法，步骤3)包括：利用浆细胞表面特异性标志物，设计并合成可特异性识别所述标志物的免疫磁珠，对淋巴细胞进行分选，获得稀有浆细胞。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤4)将分选的稀有浆细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0按照1:(0.2-5)的比例混合，细胞总数为2
×
10
3-2
×
106进行电融合；优选地，稀有浆细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0的比例为1:0.2、1:0.5、1:1、1:2或1:5。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，电融合分为三个阶段：排队阶段、融合阶段和修复阶段；排队阶段电压设置为15-40v，时间为10-50s，频率为0.8-1.8mhz；融合阶段电压设置为30-100v，电穿孔1-3次，时间为20-100μs；修复阶段电压设置为30v逐渐降至5v，时间为10-60s；优选地，排队阶段电压设置为15v、20v、25v、30v、35v或40v，时间为10s、20s、30s、40s、50s或60s，频率为0.8mhz、1.0mhz、1.2mhz、1.4mhz、1.6mhz或1.8mhz；融合阶段电压设置为30v、40v、50v、60v、70v、80v、90v或100v，时间为20μs、40μs、60μs、80μs或100μs；修复阶段电压设置为30v逐渐降至5v，时间为10s、20s、30s、40s、50s或60s。7.按照权利要求1-6任一项所述方法制备的杂交瘤细胞。8.抗afm1单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为cgmcc no.45242的小鼠杂交瘤细胞株afm1分泌产生。9.由权利要求8所述单克隆抗体制备的afm1检测试剂或试剂盒。10.权利要求8所述单克隆抗体的以下任一应用：(1)用于afm1检测；(2)用于制备afm1检测试剂或试剂盒；(3)用于制备检测afm1的免疫层析试纸条。

技术总结

本发明提供一种基于细胞分选与微流控电融合技术的单克隆抗体制备方法，包括：1)针对特定化合物，设计人工抗原；2)用人工抗原免疫实验动物，分离淋巴细胞；3)用免疫磁珠法对淋巴细胞进行分选，获得稀有浆细胞；4)将分选的稀有浆细胞与骨髓瘤细胞混合，采用微流控电融合芯片进行细胞融合，从融合细胞中筛选出分泌抗该化合物的单克隆抗体的杂交瘤细胞。本方法操作简单，为高性能单克隆抗体的精准制备奠定基础，在科研与实际生产中具有广阔的应用前景。景。