绿僵菌无纺布菌条制作工艺
中国生物防治ChineseJournalofBiologicalContml2007年5月 绿僵菌无纺布菌条制作工艺
徐金柱，何雪香，秦长生，李增智
(1广东省林业科学研究院，广州510520.;2.安徽农业大学微生物防治重点实验室，合肥230036)
摘要：在接种优良液体种子的基础上，以单位面积的产孢量为指标，筛选了制作多种蛀干害虫
的病原——绿僵菌无纺布菌条的最佳营养组合及培养条件.结果表明，最佳营养条件为(g/ L)：白砂糖20g，黄豆粉40g，蛋白胨6g；琼脂含量对产孢量无显着影响；最佳培养条件为:25oC 下，相对湿度(RH)95%，产孢量可达3.6×10～3.7×10孢子/cm2.
关键词：无纺布菌条；绿僵菌；培养参数
中图分类号:$476.12文献标识码:A文章编号:1005.9261(2007)02.0147.04 MakingTechnicsofNonwovenF
abricStripswithMetarhiziumanisopliae XUJin—zhu,HEXue—xiang,QINChang—sheng,LIZeng—zhi (GuangdongForestResearchInstitute,Guangzhou510520,China)
Abstract:Onthebasisofinoculatingbestliquidseeds.ththeamountofsporespersquarecenti meter
astarget,thebestnutftionandproducingparametersofnonwovenfabricstrips(Nss)ofMetar huzium
anisopliaewerestudied.Theresultsshowedthatsoybeanpowder4%,commercialsugar2%, peptone
0.6%wasthebestnutrition,andrelativehumid95%,25oC,pH6.3—6.5werethebestenvironmen—
talparametersforNFSproduction,andtheNSPcanreach3.6×100—3.
7×100spores/cm2.
Keywords:nonwovenfabricstrip;Metarhiziumanisopliae;incubationparameter
制作纪念章杀虫微生物在农，林业的害虫防治中正起到13益重要的作用.病原真菌因为能在林间适
宜条件下宿存及繁殖，保持较高带菌量，能随着害虫虫口的增长而增长的特点，而成为调节害
虫虫口密度的一个重要因子.无纺布具有良好的通气和吸水性能，可以为真菌在林间大量宿
存提供一个良好的微环境.同时无纺布菌条在防治蛀干害虫方面有着增加与害虫的接触机
会，提高杀虫率的独特优势，在害虫防治应用与野外试验已起到了很好的防治效果. 目前，白僵菌的无纺布菌条已进入野外试验及田间应用阶段¨卫J.而绿僵菌(Metarhizium
anisopliae)作为一种重要的病原真菌，多种蛀干害虫的病原～5J，虽然在地下害虫防治方面得
到了一些应用，但因为剂型等原因，在防治林业上某些重要性害虫(如光肩星天牛，松墨天牛)
的应用还很少，因此有必要研究相应的剂型——无纺布菌条.
收稿日期:2006—07—06
基金项目：安徽"十五"攻关项目(01013005)
作者简介：徐金柱(1978一)，男，林业工程师，在读博士;*通讯作者，博导.
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中国生物防治第23卷
监视设备
1材料与方法
1.1供试材料
菌种金龟子绿僵菌Ma09由安徽农业大学微生物防治重点实验室提供.液体母种参考徐
金柱等_6J方法制作.
1.2.1正交试验优化碳氮源组合根据液体种子培养条件筛选的结果，用70L液体发酵罐生
产优良液体种子作母种，接种无纺布条培养为菌条.以菌条单位面积分生孢子产量作为指标,
通过Ll6(44)正交试验确定碳源，氮源，碳源浓度和氮源浓度，筛选绿僵菌Ma83无纺布菌条生
产的最佳营养条件.不同的碳氮源及浓度组合见表1.
1.2.2无纺布菌条的培养方法及孢子测定方法按100ml/L的接种量将培养好的经高速匀
浆的液体种子用16种待测培养基(组合方式按Ll(44)正交试验)稀释，混匀，浸透无菌无纺布
(20cm×5cm×lcm)，平铺于25±1℃培养箱的培养架上，每种培养基处理10条，在培养箱下层
放上无菌水，并定期(每隔12h左右)向培养箱喷无菌水以保持箱内湿度达饱和.待产孢完全
异丙醇钛(约12d左右)，从每个处理的无纺布菌条上随机取样，加入适量0.05%吐温.80溶液，洗下菌条
上的孢子，血球计数板计数单位面积无纺布菌条上的产孢量.结果经方差分析，比较各组问差
异，确定无纺布菌条培养的最佳碳，氮源组合.每处理3个重复.
1.2.3蛋白胨含量对菌条培养的影响根据营养条件筛选结果，确定基础培养基为20g/L葡
萄糖,40L黄豆粉煮汁，加无机盐溶液.在基础培养基里分别加入 3.6,9,12,15,18g/L 的
蛋白胨配制成6种培养基，以不加蛋白胨作为对照，每个处理3个重复.培养及孢子计数方法
同1.2.2.
1.2.4琼脂含量对菌条培养的影响采用悬挂式培养无纺布菌条时，接种后因为重力的作用
部分营养液流失，影响菌条的质量，通常采取在培养基中加入10g/L的琼脂以减少营养成分的
流失，提高单位面积的产孢量.在生产工艺改成平铺式培养后，能有效减少营养成分的流失,
但仍有一定量的损失.本试验是以单位面积产孢量为指标考察琼脂含量对产孢量的影响，在
基础培养基上分别加入5,10,15,20g/L的琼脂作不同处理，以不加琼脂作为对照，每处理3个
重复.培养及孢子计数方法同1.2.2.
1.3温度，湿度对菌条产孢量的影响
恒温培养箱温度分别设为20±1,25±1,30±1,35±1℃培养，考察温，湿度对无纺布菌条
产孢的综合影响.用不同盐的饱和盐溶液设置相对湿度(双蒸水=:~RH100%;K2s04=:~RH95%;
KCI~RH85%;NaNO3j75%;Mg(NO3)2RH53%).在20cm×5cm×lcm的无纺布条上浸透接
种后的营养液(制备同 1.2.2)，分别放置在盛有不同饱和盐溶液的容器(30cm×20cm×10cm)
的架子上(保鲜膜封口保湿)，于不同温度条件下培养.每处理3条无纺布，每个处理3个重
复.每天定时打开通气，观察生长情况，并补充适量的相对应的饱和盐溶液以保持相对湿度.
培养到充分产孢后(约12d)，随机取样，测定孢子含量.
2结果与分析陶瓷滤波器
2.1无纺布营养条件的筛选
2.1.1碳，氮源及浓度的筛选培养基筛选正交试验结果(表1)表明，不同的培养基组合产生
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第2期徐金柱等：绿僵菌无纺布菌条制作工艺
的生物量间差异较大，从各因子的极差可以看出,c,D,A,B的极差依次减小，其中因子c的极
差最大,D,A,B间的极差相差不大.说明氮源种类对绿僵菌菌株的产孢影响最大，其次是氮
源含量；碳源虽然对产孢有一定的影响，但影响远不如氮源.正交试验结果还表明，无纺布菌
条的最佳培养基组合为A2B2c1D，即葡萄糖20g/L，黄豆粉40g/L，此结果与经Duncan新复极差
测验的多重比较得出的结论一致，即第六种培养基组合.但是从因子A的方差分析结果来
看,A，和Ad间在a=0.01水平上差异不显着，而从经济角度来看，白砂糖的市售价格要比葡萄
糖低得多，故在生产中宜选择白砂糖代替葡萄糖进行规模性生产.所以最终营养选择
A4B2ClD4组合作为Ma83菌条规模生产营养组合，即白砂糖20g/L，黄豆粉40g/L. 表1无纺布菌条培养营养条件筛选正交分析表
注:Dunealfl's新复极差测验，口=0.O1.
2.1.2蛋白胨含量对菌条产孢量的影响据报道[6]，蛋白胨对绿僵菌的产孢有一定的促进作
用，试验结果(图1)也证明了这一观点.加蛋白胨组的产孢量普遍高于对照组，单因素方差分
析表明蛋白胨组与对照组间的差异极显着(a=0.01);3g/L组和其他含量组间差异显着(a=
0.05)，而大于3g/L的组间差异不显着.因此选择在培养基中加入蛋白胨6g/L.
2.1.3琼脂含量对菌条产孢量的影响试验结果(图2)表明，营养的损失不影响菌条的产孢
量，琼脂的含量对产孢量无明显影响，组间差异不显着.这是因为平铺式培养在吸
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